현미경 성능 모니터를 사용한 신뢰할 수 있는 정량적 컨포컬 형광 이미징

서론

광학 현미경을 사용한 형광 이미징은 주로 정성적 관찰에 사용되지만, 정량적 분석을 위한 사용이 증가하고 있습니다. 이 경우, 주변 온도 변화와 같은 원인으로 광원의 출력이 변동되어 이미지 품질이 저하될 수 있으므로 정기적인 유지 관리가 권장됩니다. 또한, 시스템의 열 팽창으로 인해 광원에서 현미경 프레임으로의 광학 활동이 약간 불일치하게 되어 시스템의 레이저 출력이 변동될 수 있습니다.

컨포컬 현미경은 복잡한 장비이므로 유지 관리 또는 성능 평가를 수행하려면 교육을 받은 숙련된 기술자가 필요합니다. 실험 재현성과 연구의 질을 달성하려면 정기적인 현미경 유지 관리가 중요하며, 이 문제는 여전히 활발히 논의되고 있습니다.^1,2,3,4 국제표준화기구(ISO) 또한 이 문제를 해결하기 위해 ISO21073 2019를 발표했습니다. 이 기준은 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경의 이미지 성능을 명시하고 있습니다.⁵

Evident는 이 문제의 중요성을 인식하고 해결하기 위해 노력하고 있습니다. 당사는 FLUOVIEW™ FV4000 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경을 2023년에 출시했을 때, 핵심 실험실 관리자와 사용자가 정량적 컨포컬 형광 이미징과 이미지 품질에 영향을 줄 수 있는 세 가지 주요 성능 매개변수를 추적하는 데 도움이 되는 현미경 성능 모니터를 지원하기로 결정했습니다.

이 백서에서는 이러한 주요 성능 매개변수와 현미경 성능 모니터가 고품질 정량 이미징을 지원하는 방법에 대해 논의하겠습니다. 또한, 각 성능 특성의 측정 원칙과 기준 그리고 성능 모니터가 핵심 실험실과 정량적 형광 이미징의 효과를 극대화하고자 하는 사람들에게 제공하는 장점도 살펴보겠습니다.
 

모니터링이 필요한 정량적 형광 이미징 성능 요인

2022년, O. Faklaris 등은 정기적으로 확인해야 하는 일곱 가지 현미경 성능 지표와 관련된 권장 사항과 각 성능 지표 측정을 위한 가이드라인을 제시했습니다.⁶ 이 일곱 가지 현미경 성능 지표는 조도 출력 안정성, 이미징 성능, 시야 조명 평탄도, 색수차, 스테이지 드리프트, 스테이지 위치 반복성, 감지기 배경 잡음입니다.

그러나 한 가지 문제는 광학 현미경에 대한 상당한 전문 지식이 없으면 이러한 성능 특성을 측정하기 어렵다는 것입니다. 광학 현미경에 대한 전문 지식없이 이 일곱 가지 지표가 허용치 내에 있는지 확인하기 위해 정기적으로 현미경을 유지 관리하는 것은 쉽지 않았습니다. 특히, 여러 현미경 시스템을 담당하는 핵심 실험실 관리자에게는 더욱 어려운 일이었습니다.

Evident는 이들을 돕기 위해 첫 번째로 사용자가 형광 신호를 정량적으로 쉽게 측정하도록 지원하는 솔루션을 개발했습니다. 형광 신호의 변동은 이미지의 외형으로는 확인하기 어렵기 때문에 연구자들은 공동 위치 관찰의 색수차나 타임랩스 이미징의 스테이지 드리프트 등 쉽게 인식할 수 있는 특성에 비해 이 문제를 인식하지 못할 가능성이 높습니다. 현미경 성능 모니터의 목표 중 하나는 프로세스 초기에 성능 변동을 인식하도록 지원함으로써 연구자가 이미징 실험에서 잘못된 결과를 얻거나 반복하지 않도록 돕는 것입니다.

위에서 언급한 일곱 가지 특징 중 형광 현미경의 밝기는 주로 조도 출력 안정성, 이미징 성능, 감지 감도에 따라 결정됩니다.
그 이유는 형광 밝기가 샘플에 조사된 빛의 강도와 형광 신호 감지 역량에 따라 결정되기 때문입니다.

형광 현미경에서 샘플에 조사된 빛의 강도는 레이저 출력과 조사 영역에 따라 달라집니다. 조사 영역은 광학 기기가 얼마나 정확하게 광원에서 유입되는 빛을 단일 지점에 조사할 수 있는지를 측정하는 척도인 이미징 성능에 따라 결정됩니다. 다시 말해, 레이저 빔의 초점과 샘플에 조사된 빛의 강도 모두 이미징 성능에 따라 달라집니다.

그 다음, 형광 신호 감지 성능은 전체 시스템의 감지 감도에 따라 결정됩니다. 따라서 일관적으로 고품질 정량 형광 이미징을 수행하려면 레이저 출력, 이미징 성능, 감지 감도의 변화를 모니터링하는 것이 중요합니다.

대물렌즈를 통과해 조사되는 레이저 출력은 주변 온도나 기타 다양한 요인에 따라 변동될 수 있으므로 레이저 출력을 모니터링해야 합니다. 현미경 성능 모니터는 레이저가 파이버 출력으로부터 FV4000 시스템으로 들어간 직후 레이저 출력을 측정하므로 시스템은 현미경이 설치 당시와 비교할 때 출력이 변화되었는지 확인할 수 있습니다. 시스템은 레이저의 출력을 자동으로 조정하여 변동을 보정할 수 있으므로 시간이 흘러도 일관적인 값을 얻을 수 있습니다.

감지 감도를 모니터링하여 현미경을 설치한 후 광학 상태의 저하나 핀홀의 광학 축 불일치로 인해 감지 효율성이 감소했는지 정량적으로 이해해야 합니다. 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경에 특히 중요한 핀홀의 중심 위치는 계절 변화와 같은 온도 변화에 따라 중심 위치가 변경될 수 있습니다. 온도를 세심하게 제어하거나 온도를 일정하게 유지할 수 있는 곳에 현미경을 보관하면 감지 감도를 모니터링해야 할 필요가 없을 수 있지만 환경이 일정한 곳에 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경을 설치하지 못하는 경우도 있습니다. 또한, 흔히 있는 일은 아니지만 렌즈 표면의 먼지와 긁힌 자국 때문에 광투과가 감소할 수 있습니다. 이러한 변화는 점진적으로 일어나므로 성능의 점진적인 저하를 인식하기 어려울 수 있습니다.

이미징 성능의 변화는 주로 대물렌즈 표면의 긁힌 자국, 먼지, 잘못된 이멀젼 오일 사용이나 보정환 때문에 발생합니다. 사용자가 현미경에 대한 풍부한 지식이 없으면 이러한 이미징 성능 문제 대부분을 인식하기 어렵습니다. 어떤 사례에서는 대물렌즈를 떨어뜨려 성능 문제가 발생했으나 이를 보고하지 않았기 때문에 핵심 실험실 관리자는 이 문제를 인지하지 못한 경우도 있었습니다.

위에서 설명한 이미징 성능 문제는 대물렌즈와 관련된 문제로 인해 발생하지만, 온도 변화로 인해 광학 축과 불일치하게 된 미러와 렌즈 등 다른 요인 때문에 성능 문제가 발생하는 경우도 많습니다.
 

현미경 성능 모니터의 작동 원리

현미경 성능 모니터는 레이저 출력, 감지 감도, 이미징 성능을 독립적으로 측정합니다. 각 특성을 시스템이 측정하는 방법은 아래에 설명되어 있습니다.

레이저 출력

현미경 성능 모니터의 레이저 출력 측정 시스템은 그림 1에 대략적으로 묘사되어 있습니다. 측정이 시작되면 시스템은 자동으로 다음 프로세스를 실행합니다.

1) 405nm 레이저를 100%로 설정, 다른 레이저는 0%로 설정합니다.

2) 레이저가 조사됩니다.

3) 레이저는 FV4000으로 파이버 도입 직후 빔 분리기(beam splitter, BS)에 의해 부분적으로 반사됩니다.

4) 입력된 레이저는 FV4000 안에 설치된 광 감지기(레이저 출력 모니터, LPM)로 이동합니다.

5) 시스템은 실제 LPM 출력 값으로부터 100%에서 레이저 출력을 계산합니다

6) 레이저를 0%로 설정한 다음 단파장 레이저를 100%로 변경합니다.
설치된 모든 레이저에 대해 순서대로 2~6단계를 반복합니다.

_{그림 1: 레이저 출력 측정 시스템 개략도.}

레이저 출력 자동 보정은 LPM이 측정한 값을 사용하여 수행됩니다. 측정된 전류 출력은 현미경 설치 당시의 출력과 비교되고 그 차이가 백분율로 계산됩니다. 레이저 출력을 일정하게 유지하기 위해 계산된 백분율을 기반으로 레이저 제어 매개변수가 조정됩니다. Evident는 이미징 실험을 수행할 때마다 레이저 출력을 일정하게 유지하기 위해 이미지 획득 전에 이 레이저 출력 모니터 기능을 활성화할 것을 사용자에게 권장합니다.

현미경 성능 모니터가 측정한 레이저 출력이 샘플에 방출된 실제 빛의 강도와 어느 정도 일치하는지 알아보기 위해, 성능 모니터가 측정한 레이저 출력과 대물렌즈가 방출한 레이저 출력을 6개월 동안 추적했습니다. 그 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 대물렌즈에서 방출된 레이저 출력은 UPLSAPO10X 대물렌즈로 측정했습니다.

그림 2에서 볼 수 있듯이, 현미경 성능 모니터가 측정한 레이저 출력과 대물렌즈가 방출한 레이저 출력 사이에는 높은 상관관계가 있습니다. 정확도는 5% 이내인 것으로 확인되었습니다. 그러나 레이저가 낮은 값으로 설정되어 있고 기기가 충분히 예열되어 있지 않으면 대물렌즈에서 방출되는 레이저 출력이 안정적이지 않습니다. 그림 3은 시스템을 2시간 동안 예열하는 동안 기록된 결과를 보여줍니다. 대물렌즈에서 방출된 레이저 출력의 변화는 다음과 같은 6개의 레이저 설정 지점에서 기록되었습니다. 1%, 10%, 25%, 50%, 75% 및 100%. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 레이저 설정 값이 낮을수록 예열 효과가 더 두드러집니다. 당사는 이러한 데이터를 기반으로 시스템을 최소한 60분 동안 예열한 다음 현미경 성능 모니터를 사용하여 이미징 전에 여기 출력을 보정할 것을 권장합니다.

_{그림 2: 대물렌즈에서 방출된 레이저 출력과 성능 모니터가 측정한 레이저 출력 결과 비교.}

_{그림 3. 예열 동안 여러 레이저 설정 값(1%, 10%, 25%, 50%, 75% 및 100%)으로 대물렌즈에서 방출된 레이저 출력의 변화.}

정기적으로 레이저 출력을 모니터링하면 레이저 자체의 출력뿐만 아니라 레이저 컴바이너와 파이버의 결함도 감지할 수 있습니다. 출력이 현미경 시스템을 처음 설치했을 때 측정된 출력의 50% 미만으로 떨어지면 유지 관리가 필요합니다. 레이저 출력이 이 임계값에 도달하면 실제 출력이 일정하게 보정되어도 심층 관찰과 같은 일부 응용 분야에는 불충분할 수 있습니다.

레이저를 여러 시간 동안 연속으로 사용하면 시스템에서 생성되는 열이 실내 온도에 영향을 미쳐 레이저 출력이 변동될 수 있습니다. 그러므로 당사는 레이저 사용 시간을 추적하고 이미지를 획득할 때 매번 레이저 출력을 보정할 것을 권장합니다. 레이저 출력은 온도 변화에 민감하게 반응하기 때문입니다.

감지 감도

감지 감도를 유지하기 위해 각 감지기 민감도와 핀홀 위치라는 두 가지 특성을 측정합니다. 각 감지기 감도를 측정하는 시스템의 개요는 그림 4에 나와 있으며 그림 5는 감지 감도에 따라 이미지가 획득되는 순서를 보여주는 순서도입니다. 레이저 출력 측정과 마찬가지로, 측정이 시작되면 시스템은 자동으로 다음 프로세스를 실행합니다.

감지 감도

1) 빔 분리기 BS10/90을 선택하고 405nm 레이저와 감지기 1을 ON으로 설정합니다(선택된 감지기로 레이저가 반사되도록 광학 경로는 자동으로 조정됩니다).

2) 현미경 프레임의 미러 터렛에 삽입된 코너 큐브 미러가 레이저 광을 반사하며 레이지 출력을 줄입니다.

3) 레이저 광이 빔 분리기와 핀홀을 통과하여 FV4000 감지 시스템으로 전달됩니다.

4) 설치 당시 측정된 동일한 감지기의 감도와 비교하여 감지기의 상대 감도(이미지의 중앙값)를 계산합니다.

5) 감지기 1을 OFF로 전환하고, 감지기 2를 ON으로 전환한 후, 2~4단계를 반복합니다.

6) 설치된 모든 감지기에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

핀홀 위치

7) 감지기 1을 다시 선택하고 10개의 핀홀 광학 축 위치(X 및 Y 축 각각에 5개의 위치, 핀홀 표면은 XY 축임) 각각에서 2~4단계를 10회 반복합니다.

_{그림 4: 감지 감도 측정 시스템 개략도.}

_{그림 5: 감지 감도 측정 순서도.}

감지 감도를 측정하려면 각 감지기의 감도 변화와 핀홀 광학 축의 적절한 이동 위치를 측정해야 합니다. 기기의 전체 감지 감도 감소의 원인은 핀홀 광학 축 위치의 불일치일 수 있습니다.

11개 핀홀 광학 축 위치와 X축 및 Y축 방향의 해당 감지 시스템 출력 값 간의 관계를 보여주는 그래프는 그림 6의 왼쪽 상단과 가운데 상단에 나와 있습니다. 이 그래프들은 또한 11개의 데이터 포인트 중 5개를 사용해 생성한 가우시안 근사 곡선을 보여줍니다. 핀홀 광학 축의 중앙 위치에 대한 데이터를 얻을 수 없는 경우에도 가우시안 근사를 사용하여 변위 정도를 높은 정확도로 계산할 수 있습니다.

핀홀 광학 축 불일치로 인한 형광 강도 감소 정도는 대물렌즈의 배율과 개구수(NA)에 따라 결정됩니다. 핀홀은 대물렌즈의 초점면에 접합되어 배치되고, 핀홀면의 에어리 크기(Airy size)는 대물렌즈 배율, 프로젝션 렌즈 배율, 초점면의 에어리 크기라는 세 가지 요인에 따라 결정됩니다.

그림 6의 오른쪽 상단 그래프는 두 가지 유형의 대물렌즈가 사용된 경우 핀홀 광학 축 불일치의 정도와 세포 표본의 형광 강도 사이의 관계를 보여줍니다. 그림 6의 하단에는 예시 형광 이미지, 즉 핀홀 광학 축이 각각 -0.5 AU, 0 AU(표준) 및 +0.5 AU 이동된 UPLXAPO20X 대물렌즈로 촬영한 세포 이미지가 나와 있습니다. 그림 6의 오른쪽 상단 그래프는 이 이미지들과 UPLXAPO20X(NA 0.8) 및 UPLSAPO100XS(NA 1.35) 대물렌즈로 각 변위량에서 획득한 이미지들의 형광 강도를 기반으로 작성되었습니다.

결과는 1배 배율의 프로젝션 렌즈를 사용한 경우이며, 핀홀 광학 축이 0.32 AU만큼 이동될 경우(UPLXAPO20X 대물렌즈의 경우 에어리 크기를 1로 가정), UPLXAPO20X는 형광 강도가 10% 감소하고 UPLSAPO100XS는 1.1% 감소함을 보여줍니다. 이는 대물렌즈에 따라 핀홀 광학 축 불일치의 영향이 달라진다는 것을 보여줍니다.

_{그림 6: 측정된 핀홀 광학 축 불일치 값과 감지 감도 비교(왼쪽 상단, 가운데 상단) UPLXAPO20X 및 UPSAPO100XS 대물렌즈의 형광 강도와 핀홀 광학 축 불일치 비교(오른쪽 상단). 핀홀 광학 축이 각각 -0.5 AU, 0 AU 및 +0.5 AU만큼 이동된 UPLXAPO20X 대물렌즈로 획득한 세포 이미지(하단).}

각 감지기의 감도가 시스템 설치 당시에 측정된 수치와 비교하여 80% 미만으로 감소하면 유지 관리가 필요합니다. 핀홀 위치를 판단하는 기준은 가장 큰 영향을 주는 것으로 여겨지는 UPLXAPO20X를 사용한 경우 형광 강도의 감소율입니다. 연구자가 직접 감지기 감도와 핀홀 위치를 조정하기 어려우므로 결과가 계속 "Failed(실패)”로 나타날 경우 Evident에 연락하시기 바랍니다.

또한, 주변 온도가 변하고 시스템이 예열되면 감지 감도가 약간 변화될 수 있으므로 중요한 정량 이미징이 필요한 경우 감지 감도를 자주 그리고 매번 측정할 것을 권장합니다.

이미징 성능

그림 7은 엣지 차트 표본의 3차원 반사 관찰을 사용하여 3차원 선상 분포 함수(3D LSF)를 계산하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스는 반사된 이미지 측정부터 이미징 성능의 정량적 평가까지 아래의 단계를 따릅니다.

1) 측정할 대물렌즈를 선택합니다.

2) FV4000 스테이지에 엣지 차트 표본을 설정합니다.

3) 561nm 레이저를 켜고, 빔 분리기 BS10/90을 설정하고 하나의 감지기를 활성화합니다.

4) 핀홀을 2 AU로 설정하여 엣지 차트 표본의 3차원 컨포컬 반사 이미지를 획득합니다.

5) 3D 이미지로부터 8개의 방향으로 구성된 3D 엣지 응답을 추출합니다.

6) 엣지 응답을 구분하여 LSF를 계산합니다.

7) 이상적인 이미징 성능으로 3D LSF 및 LSF의 2D 교차 상관관계 값을 계산합니다. 상관관계 값은 ZNCC(Zero-means Normalized Cross-Correlation)를 사용하여 얻었습니다.⁷

_{그림 7: 3D LSF 추출 방법 개략도. XZ 방향으로 8개의 LSF가 추출되었습니다.}

현미경 성능 모니터는 대물렌즈 설정, 초점 조정, 엣지 패턴 센터링과 같은 수동 개입을 요구하는 작업을 제외하고 다른 모든 작업을 자동으로 수행합니다.

높은 정확도로 3D LSF를 측정하는 데 세 가지 고유한 접근 방식이 사용되었습니다. 첫째, 디포커싱 동안에도 더 많은 반사광 강도가 감지되도록 의도적으로 핀홀을 2 AU로 설정했습니다. 둘째, 디포커싱 동안 주변 쌍의 반사광의 간섭을 방지하는 일반적인 스타 차트와 비교할 때 8개밖에 안되는 밝은/어두운 스트라이프 쌍이 있는 표본을 사용했습니다. 셋째, 엣지 패턴을 매우 얇게 만들어 이론적 값에 가까운 엣지 응답을 얻을 수 있었습니다. 이러한 접근 방식 덕분에 더 정확하고 신뢰할 수 있는 3D LSF 측정을 수행할 수 있었습니다.

이미징 성능을 평가하는 데 흔히 사용되는 점 확산 함수(PSF)는 단일 지점이 이미지에 어떻게 나타나고 이미징 성능의 이방성 저하를 어떻게 포착할 수 있는지를 보여줍니다. 그러나, LSF는 선이 어떻게 이미지화되고 특정 방향으로 이미징 성능의 저하를 어떻게 놓칠 수 있는지를 보여줍니다.

위에 설명한 방법에서 3D LSF는 8개의 방향으로 획득되어 3차원 PSF(3D PSF)와 거의 동등한 정보를 제공합니다. 그림 8은 대물렌즈가 기울어지거나 표본 커버 유리 또는 스테이지가 대물렌즈를 기준으로 기울어진 경우 발생하는 코마수차가 있을 때 8개 방향으로 시뮬레이션된 3D PSF 및 2D LSF 결과를 보여줍니다.
3D PSF는 바나나 모양이며, 2D LSF도 비슷한 바나나 모양을 띕니다. 그러나 특정 방향에서는 코마수차와 같은 이방성 수차가 2D LSF에 의해 포착되지 않으며, 무수차처럼 보일 수 있습니다. 8개의 방향으로 2D LSF를 획득하면 3D PSF뿐만 아니라 이방성 정보도 포착할 수 있습니다.

_{그림 8. 시뮬레이션을 통해 얻은 3D PSF 및 3D LSF 비교.}

8개 방향의 LSF가 PSF와 동일한 수준에 있는지 정량적으로 확인하기 위해 코마수차와 구면수차의 정도를 변화시키면서 PSF의 스트렐 비율과 LSF의 ZNCC를 계산했습니다. 스트렐 비율은 빛 수집 강도를 정량적으로 나타내는 값이며, 수차 없는 광학 시스템으로 얻은 이상적인 PSF에서의 중심 강도가 100%일 때 실제 광학 시스템의 PSF에서의 중심 강도 비율로 표시됩니다. 스트렐 비율은 또한 대물렌즈 품질 관리 지표 중 하나인 파면수차와 높은 상관관계를 나타내는 것으로 알려져 있습니다.

코마수차는 앞서 설명한 대로 현미경 사용 시 발생하는 수차 중 하나이며, 구면수차는 대물렌즈 보정환의 부적절한 조정, 잘못된 이멀젼 매체 사용 또는 대물렌즈나 샘플 표면에 실수로 묻은 액체로 인해 발생할 수 있는 또 다른 수차입니다. 이 그래프는 이러한 수차의 영향을 보여줍니다. ZNCC 값은 8개 방향으로 계산한 결과의 평균입니다. 또한 참조용으로 PSF의 절반 최대에서의 전체 너비(full width at half maximum, FWHM)를 스트렐 비율과 비교하는 그래프도 제시되어 있습니다. 스트렐 비율과 FWHM은 PSF의 정량적 지표 두 가지입니다.

그림 9의 그래프는 선형 회귀에서 0.959의 높은 결정 계수 R2로 PSF의 스트렐 비율과 LSF의 ZNCC 사이에 높은 상관관계가 있음을 보여줍니다. 이는 3D LSF의 ZNCC를 3D PSF의 스트렐 비율 대신 사용할 수 있음을 나타냅니다. 반면, FWHM과 스트렐 비율 사이에는 상관관계가 있어도 획일적인 임계값을 설정할 때 주의가 필요함을 시사합니다. 예를 들면, 측정된 FWHM이 340nm인 경우, 이론적인 값인 320nm에 가깝기 때문에 이미징 성능에 문제가 없을 것으로 가정할 수 있지만, 구면수차 때문에 스트렐 비율이 65%로 감소될 수 있는 경우가 있을 수 있습니다. 그러나, 3D LSF로 계산한 ZNCC는 PSF의 FWHM보다 높은 정확도로 이미지 형성 성능을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

또 다른 지표인 스트렐 비율을 직접 측정하려면 현미경의 파면수차 측정을 위한 별도의 기기가 필요하므로 사용자가 직접 측정하는 것이 어렵습니다. 대신, 사용자는 ZNCC를 사용하여 이미징 성능을 결정할 수 있습니다.

_{그림 9. 3D PSF로 계산한 스트렐 비율과 3D LSF로 계산한 ZNCC(위) 및 3D PSF로 계산한 FVHM(아래) 간의 관계}

유지 관리를 시작해야 하는 이미징 성능 관련 상태는 스트렐 비율인 80% 미만으로 떨어지는 경우입니다. 일반적으로, 스트렐 비율의 80%를 회절 한계라고 부르며, 스트렐 비율이 80% 미만인 대물렌즈는 성능이 만족스럽지 않습니다. Evident는 FV4000 시스템을 시작할 때마다 이미징 성능 점검을 실행할 것과 그리고 사용자가 바뀌거나 사용 시간이 24시간을 초과하면 이 점검을 재실행할 것을 권장합니다.
 

현미경 성능 모니터 활용 사례

그림 10은 형광 정량화 실험에서 대조 샘플을 정량적으로 평가한 결과를 보여줍니다. 대조 샘플은 실험마다 다르지만, 이 예에서는 형광 강도 표준을 조정하는 데 사용되는 샘플로 정의합니다. 여기서, 두 번째 실험은 첫 번째 실험 후 한 달 후에 수행되었습니다. 첫 번째 실험은 형광 관찰 조건이 설정된 후 수행되었고, 두 번째 실험은 기기를 켠 직후 수행되었습니다.

레이저를 포함한 컨포컬 현미경은 제조사의 사양에 따라 예열해야 하지만, 영향을 분명하게 보여주기 위해 시동 직후 실험을 실시했습니다. 그림 10의 그래프는 현미경 성능 모니터를 사용하거나 사용하지 않았을 때 첫 번째 및 두 번째 대조 샘플의 형광 강도가 어떻게 다른지 비교합니다.

결과에 따르면, 현미경 성능 모니터를 사용하여 보정을 수행하지 않은 경우에는 기기 시동 직후 성능이 불안정하고 데이터가 큰 폭으로 변동되는 것으로 나타났습니다. 반면, 성능 보정이 수행된 경우에는 여러 날에 걸쳐 수행된 실험에서도 높은 정확도의 형광 정량화가 가능했습니다.

_{그림 10. 2일간의 실험 동안 대조 샘플의 형광 강도 변화.}
 

요약

현미경 성능 모니터는 FV4000 레이저 스캐닝 컨포컬 현미경을 위한 반자동 유지 관리 기능을 제공합니다. 따라서 유지 관리 작업의 효율성을 높일 수 있고 다른 사용자에게 유지 관리 교육을 실시할 필요가 없습니다. 또한, 이 시스템은 관리자가 문제 해결에 시간을 사용하지 않도록 돕고 분명한 데이터를 제공하므로 제조사와 대화 시 현미경 시스템의 문제가 정확히 무엇인지 더 쉽게 이해시킬 수 있고 다운타임을 최소화할 수 있습니다. 또 하나의 장점은 현미경 성능 모니터가 제공하는 데이터로 장비 예열의 중요성, 대물렌즈 보정환 조정, 대물렌즈에서 방출되는 레이저 출력의 변동에 대해 사용자를 교육할 수 있다는 것입니다.

실험에 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용하는 연구자는 사전에 형광 강도 변동과 관련하여 현미경 성능을 모니터링하여 형광 정량화의 가변성을 대폭 낮춤으로써 더 일관적인 이미지와 정량적 데이터를 얻을 수 있습니다. 그리고 현미경 성능 모니터의 반자동 측정 기능을 사용하면 초보 사용자도 쉽게 측정을 수행할 수 있습니다. 또한 예상치 못한 실험 결과가 나올 경우, 이 성능 모니터는 문제가 현미경 또는 샘플 중 무엇 때문에 발생했는지 알아낼 수 있도록 도움을 줍니다.

당사는 개별 사용자 실험의 재현성뿐만 아니라 연구 논문의 재현성까지 향상하는 것이 연구자들에게 중요하다고 생각합니다. 이를 위해, Evident는 현미경 성능 측정 데이터의 추적 가능성을 향상하기 위한 노력을 계속할 것입니다.

*이 콘텐츠는 RIKEN CBS-EVIDENT Open Collaboration Center(BOCC)에서의 기술 발전 상황을 반영하여 작성되었으며 특허 출원 중입니다.
 

작성자

Yasuo Yonemaru
Evident Corporation, R&D, 고급 기술 부문

1. G. Nelson, et al. “QUAREP-LiMi: A community-driven initiative to establish guidelines for quality assessment and reproducibility for instruments and images in light microscopy”, Journal of Microscopy, vol. 284 (1), 56–73, (2021).
2. U. Boehm, et al. “QUAREP-LiMi: A Community Endeavor to Advance Quality Assessment and Reproducibility in Light Microscopy.” Nature Methods, vol. 18, 1423–1426. (2021).
3. H. K. Jambor. “A Community-Driven Approach to Enhancing the Quality and Interpretability of Microscopy Images.” Journal of Cell Science vol. 136 (24), jcs261837, (2023).
5. ISO 21073-2019 “Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging”
6. O. Faklaris, et al. “Quality Assessment in Light Microscopy for Routine Use through Simple Tools and Robust Metrics.” Journal of Cell Biology, vol 221 (11), e202107093, (2022).
7. Lewis, J. P. "Fast Normalized Cross-Correlation." Industrial Light & Magic, 1995.