How Olympus Super Resolution and Spinning Disk Technology Achieves Fast, Deep, and Reliable Live Cell Super Resolution Imaging

서론

형광단백질이 발견되고 수십 년이 흐른 후 라이브 셀 이미징은 생명과학 연구 분야에서 조직 및 세포 내부의 세포 내 기능을 조사할 때 없어서는 안 될 도구가 되었습니다. 오늘날의 형광 이미징은 다양한 초고해상도 현미경 검사 기법을 토대로 더욱더 발전하고 있습니다. 초고해상도 이미징은 200nm(nm=10^-9m) 미만의 미세 구조를 관찰할 수 있다는 점에서 생명과학 분야의 혁명적인 도구로 관심을 받고 있습니다. 이는 기존 광학 현미경으로는 불가능한 이미징 성능입니다. 그러나 라이브 셀 이미징에 초고해상도 현미경 검사 기법을 적용하는 것은 시간 분해능 및 광독성 문제 때문에 제한됩니다. 또한, 이미징 데이터의 신뢰성(정량적 성능)도 큰 염려거리입니다. 추정 또는 공간 주파수 이동 등의 이미지 처리에서 아티팩트가 형성되어 결과를 오염시킬 수 있기 때문입니다.¹

이에 Olympus는 초고해상도 라이브 셀 이미징을 위한 초고해상도 IXplore SpinSR 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 컨포칼 형광현미경의 광절단 능력뿐 아니라 초고해상도 구성요소도 활용합니다. IXplore SpinSR 시스템은 높은 신뢰성과 빠른 이미지 획득, 낮은 광독성, 심층 조직 관찰을 동시에 제공하며, 이는 기존의 방법으로는 불가능한 것입니다. 데이터 신뢰도는 Olympus 초고해상도(OSR) 기술 덕분에 보장됩니다. 광학 이론을 기반으로 하는 Olympus의 OSR 처리 알고리즘은 120nm의 공간 해상도를 달성할 수 있으며, 회절 한계를 넘지 않는 범위에서 매우 신뢰성 있는 결과를 제공합니다. 빠른 이미지 획득은 회전 원판식 컨포칼 현미경 기법 덕분에 가능합니다. 초고해상도 SoRa 디스크 기술을 사용하면² 광독성도 기존 기법에 비해 30% 낮아집니다. 심층 조직 관찰은 실리콘 이멀젼 대물렌즈³와 컨포칼 현미경의 광절단 능력 덕분에 가능합니다.

이 글에서는 Olympus 초고해상도(OSR) 기술 이면의 원칙과 IXplore SpinSR 시스템의 광학 디자인에 대해 설명합니다.
 

초고해상도란 무엇인가?

형광현미경의 공간 해상도(δ_r )는 작은 두 점 사이에서 분해할 수 있는 최소 거리로 정의됩니다. 레일리 기준에 따르면, 공간 해상도는 등식 1과 같이 표현됩니다.

등식 1

해상도(δr)는 상평면 위에 있는 단일 형광점으로 이루어진 강도 분포에서 구합니다. 이 강도 분포는 점상 강도 분포 함수(PSF)라고 알려져 있습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이, 두 점 사이의 거리가 레일리 기준 δr보다 작으면 두 점을 구분하여 파악할 수 없습니다. 거리가 레일리 기준과 일치하는 경우, 두 점 사이의 강도는 최대 26% 감소합니다.

PSF의 분산은 차단 주파수에 따라 다르며 이들은 서로 밀접한 관계가 있습니다. 차단 주파수가 높아지면 공간 해상도 값이 감소합니다. 형광현미경의 차단 주파수(ƒ_{c_wf})는 등식 2와 같습니다.

등식 2

방출 강도 분포의 공간 주파수 정보는 차단 주파수(ƒ_{c_wf})에 의해 제한되며 상평면으로 이동됩니다. 그러므로 차단 주파수(ƒ_{c_wf} )의 역은 관찰 가능한 구조물의 크기에 대한 이론적 한계입니다. 등식 2의 차단 주파수(ƒ_{c_wf})에 의해 결정되는 해상도를 넘어서는 현미경 기법은 초고해상도 현미경 검사로 분류됩니다.

컨포칼 형광현미경의 이론적 차단 주파수는 광시야 현미경(ƒ_{c_wf},)의 2배이며, 이론적인 해상도 한계라는 관점에서 볼 때 2배 더 높은 초고해상도로 이어집니다. 그러나 실제로는 고주파수 신호가 약하기 때문에 광시야 형광현미경과 동일한 수준의 해상도를 제공하는 것이 일반적입니다. 핀홀이 좁아지면 해상도가 개선되지만 차단 주파수 근처의 신호 강도는 여전히 낮습니다. 따라서 컨포칼 형광현미경은 초고해상도 현미경으로 사용할 수 없습니다.

그림１．2점 해상도 도해
 

회전 원판식 컨포칼 형광 현미경 검사

IXplore SpinSR 시스템은 컨포칼 형광의 차단 주파수에 관한 정보를 최대한 활용함으로써 광시야 형광 현미경 검사에서 2배 더 높은 해상도를 제공합니다. 그뿐만 아니라, 회전 원판식 컨포칼 형광 현미경 검사를 활용함으로써 200fps의 빠른 이미징도 제공합니다.

컨포칼 형광 현미경 검사에서, 여기광점(excitation light spot)으로 샘플을 밝혀 생성한 방사 형광은 핀홀을 통과하여 검출기에 도달합니다. 검출된 형광 신호의 공간 분포는 2차원 스캐닝을 통해 여기광점을 스캐닝하는 동안 이미지화됩니다. 컨포칼 형광 현미경 검사는 z 차원에서 광절단할 수 있는 능력 때문에 형광 신호의 3차원 공간 분포를 얻기 위한 도구로 널리 사용됩니다.

회전 원판식 컨포칼 현미경은 많은 여기광점을 동시에 밝히며 평행한 각각의 광점에서 생성된 형광을 검출합니다. 회전식 컨포칼 원판은 여기광점을 스캔하고, 이에 상응하는 중간 상평면 위 핀홀은 초점에서 벗어난 형광을 줄입니다. 그러면 형광 신호의 공간 분포가 카메라에 의해 검출됩니다(그림 2). 그림 2의 핀홀 배열도에서 볼 수 있듯이, 핀홀과 컨포칼 원판 사이의 거리는 핀홀 사이에서 신호의 크로스토크를 예방할 수 있을 만큼 충분히 넓습니다.

IXplore SpinSR 시스템의 검출 감도는 sCMOS(Scientific Complementary Metal Oxide Semiconductor) 기술을 통해 개선됩니다. sCMOS 카메라는 컨포칼 현미경에 널리 사용되는 광전자 증배관보다 양자 효율이 높습니다. 따라서, IXplore SpinSR 시스템의 sCMOS 이미지 센서는 광전자 증배관으로는 달성할 수 없었을 높은 신호-노이즈 비율(SNR)을 가진 이미지를 획득합니다. 초고해상도 SoRa 디스크 덕분에 컨포칼 핀홀에 의한 검출 손실이 크게 감소하며, 기존의 방법에 비해 3배 더 높은 밝기에서 형광이 검출되어 광독성이 낮습니다. (부록 참조)

그림 2. 회전 원판식 컨포칼 현미경의 광학계 도해. 중간 상평면 위에 탑재된 컨포칼 원판이 중심축을 중심으로 회전하는 동안 청색 원 부분에서 여기광이 방사됩니다. 오른쪽 그림은 샘플 조명의 핀홀 배열을 보여줍니다. 핀홀은 여러 개의 여기광점을 간섭 없이 동시에 스캐닝할 수 있을 만큼 충분히 큰 간격으로 배치되어 있습니다.
 

Olympus 초고해상도(OSR) 이론

IXplore SpinSR 시스템은 핀홀 크기를 최적화함으로써 공간 주파수 검출 효율을 광시야 형광현미경 차단 주파수의 2배까지 개선합니다.⁴ 초고해상도 이미지는 획득된 이미지에 대한 OSR 처리를 통해 얻습니다. OSR은 이미지에서 특정한 공간 주파수 구성요소를 증폭하거나 약화시키는 필터링 과정입니다. 아티팩트가 거의 없는 신뢰성 있는 이미징은 획득한 이미지에서 공간 주파수 이동 없이 최적화된 증폭률을 사용하여 달성할 수 있습니다. 위너 필터는 이미지 처리에서 디콘볼루션을 위해 가끔 사용됩니다. 그러나 위너 필터는 때때로 아티팩트를 형성하여 이미지 데이터의 신뢰성을 떨어뜨립니다.

OSR 처리는 컨포칼 형광현미경 차단 주파수 근처에서 점진적으로 약해지는 아포다이제이션을 통해 고주파수 구성요소를 증폭시키는 공간 주파수 필터(OSR 필터)를 사용합니다. 이는 아티팩트가 적은 우수한 해상도로 이어집니다. 그림 3a는 OSR 필터와 위너 필터의 공간 주파수 각각에서 증폭률을 비교한 것입니다. OSR 필터가 중주파 구성요소를 과도하게 증폭하지 않고 차단 주파수 근처의 구성요소를 적당히 증폭한다는 것을 확인할 수 있습니다.

그림 3b와 3c에서는 레일리 기준에 부합하는 핀홀 크기로 컨포칼 형광현미경 이미지에 OSR 필터를 적용하기 전화 후의 점상 강도 분포 함수(PSF)와 광학전달함수(OTF)를 비교합니다. OSR 처리 시 광시야 형광현미경보다 2배 더 높은 해상도가 달성된다는 것을 확인할 수 있습니다. 

WF(2X): 차단 주파수가 2배일 때의 가상 곡선

그림 3. OSR 필터와 위너 필터의 특성과 효과. (a) 필터의 형태. (b) PSF. (c) OTF.
 

그림 4는 OSR 필터와 위너 필터를 적용한 후의 이미징 시뮬레이션 결과를 비교한 것입니다. OSR 필터를 적용한 후의 이미지(그림 4c)와 위너 필터를 적용한 후의 이미지(그림 4d)를 비교해보면, 위너 필터를 사용했을 때보다 OSR 필터를 적용했을 때 이미지에서 물체 근처에 아티팩트가 적다는 것을 확인할 수 있습니다. 그림 5는 고정된 세포 안의 착색 액틴 필라멘트를 보여주는 생물학 샘플 IXplore SpinSR 이미지입니다. 여기파장은 488nm였고 Olympus UPLSAPO100XS 대물렌즈를 사용했습니다. 그림 5a, 5b, 5c는 각각 OSR 필터를 적용하기 전, OSR 필터를 적용한 후, OSR 필터 대신 위너 필터를 적용했을 때 IXplore SpinSR 시스템으로 획득한 이미지입니다. OSR 필터는 위너 필터만큼 이미지 해상도를 개선하는 동시에 아티팩트를 줄이고 높은 SNR을 유지합니다. 그러므로 OSR 처리는 라이브 이미징 및 생물학 샘플의 정량분석에 유용할 수 있습니다.

그림 4. 이미징 해상도 시뮬레이션 결과. (a) 물체. (b) 컨포칼 형광현미경으로 획득한 이미지. (c) OSR 필터를 사용한 이미지. (d) 위너 필터를 사용한 이미지.
 

그림 5. 고정된 세포 안의 착색 액틴 필라멘트를 보여주는 형광 이미지. (a) IXplore SpinSR 시스템으로 획득한 컨포칼 형광 이미지.  (b, c) OSR 필터(b)와 위너 필터(c)를 사용했을 때의 하이라이트 표시된 부분(a)을 확대한 이미지.
 

그림 6과 7에서는 다른 예시로 형광 비드(Φ100nm)와 착색 핵공 이미지를 보여줍니다. 역시, OSR 필터가 높은 신뢰성과 SNR을 달성할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이를 통해 IXplore SpinSR 시스템의 초고해상도 기법이 라이브 셀 이미징에 적합하다는 것을 확인할 수 있습니다.⁵

그림 6. IXplore SpinSR 시스템으로 획득한 초고해상도 형광 비드 이미지(Φ100nm)와 관련 강도 프로필.
 

그림 7. 고정된 세포의 착색 핵공을 보여주는 형광 이미지. IXplore SpinSR 시스템으로 획득한 컨포칼 이미지(a)와 OSR 이미지(b).
 

광학 시스템

IXplore SpinSR 시스템은 대물렌즈, 이미징 렌즈, 확대용 광학계, 컨포칼 회전 원판, sCMOS 카메라로 이루어져 있습니다(그림 8). 컨포칼 회전 원판으로 유입된 레이저 여기광은 다수의 마이크로렌즈를 통해 여러 개의 여기광점을 형성합니다. 그러면 빛이 다이크로익 미러와 핀홀을 통과하면서 마이크로렌즈 어레이의 초점 각각에 맞춰집니다. 핀홀을 통과한 후에는 빔 크기가 대물렌즈의 동공 직경에 맞추어 조정되어 사분파장판(λ/4판)을 통과합니다. 이미징 렌즈를 통과한 평행광이 많은 여기광점으로 전환되어 대물렌즈를 통해 샘플을 비추고, 이는 형광 유도로 이어집니다. 형광은 여기광과 같은 대물렌즈에서 검출되지만 이동 방향은 반대입니다. 형광이 확대용 광학계와 관련 핀홀을 통과하면 형광점이 형성됩니다. 다이크로익 미러에 반사된 형광점은 카메라에 상을 맺습니다.

확대용 광학계는 컨포칼 관찰과 초고해상도 관찰을 전환하기 위해 사용됩니다. 초고해상도 관찰 모드에서는 형광 검출 중 핀홀에 영사되는 형광점의 크기가 최적화되고(그림 8a), 여기광이 대물렌즈의 동공을 채우도록 확대됩니다(그림 8b). 컨포칼 관찰 모드에서는 중간 상평면이 단위 배율로 샘플 표면에 영사되어 시야수(FN) 18.8에 상응하는 넓은 관측 시야에서 컨포칼 이미징이 가능해집니다. 

그림 8. 장비 구성요소의 구조. 확대용 광학계는 목적에 따라 전환됩니다. OSR을 사용하는 관측에서는 핀홀 크기를 최적화하고 대물렌즈의 동공을 완전히 채우는 배율 시스템을 사용합니다. 컨포칼 관찰에서는 넓은 관측 시야 전반에서 관찰할 수 있게 하는 배율 시스템을 사용합니다.
 

확대용 광학계가 탑재된 IXplore SpinSR은 높은 필드 평편도를 제공하며, 현미경의 광학계와 컨포칼 회전 원판 유닛을 연결하여 수차를 최소화하도록 설계되었습니다. 그림 9는 인접한 형광 이미지 16개를 이어붙인 이미지(세로 4 × 가로 4)를 보여줍니다. 그림 9b와 9a는 각각 IXplore SpinSR용 광학계와 일반 광학계를 사용하여 획득한 이미지를 보여줍니다. 일반 광학계를 사용하여 획득한 이미지에서는 작은 형광 이미지의 이음부 근처에서 격자형 강도 분포가 관찰되고 강도가 감소한 것을 확인할 수 있습니다. 그에 반해서, IXplore SpinSR용 광학계는 아티팩트 없이 높은 평탄도를 제공하는데, 이는 필드 주변부까지 IXplore SpinSR 시스템의 광학 성능을 제공할 수 있도록 배율 광학계가 최적화되어 있음을 나타냅니다.

그림 9. 인접한 형광 이미지 16개(세로 4개 x 가로 4개)를 이어붙인 이미지. 각각의 형광 이미지는 IXplore SpinSR용으로 설계된 광학계(b)와 일반 광학계(a)를 사용하여 획득했습니다.
 

λ/4판은 X방향과 Y방향 양쪽에서 동등한 해상도를 얻을 수 있도록 레이저 여기광의 직선 편광을 원편광으로 바꿉니다. 그렇지 않으면 직선 편광이 X방향과 Y방향에서 서로 다른 반전치폭(FWHM) 값을 갖는 회절 제한 스팟을 형성하고 타원형 여기광점이 만들어지게 됩니다(그림 10 삽화). 그림 10에서 볼 수 있듯이, UPLSAPO100XS 대물렌즈를 사용할 경우 X방향과 Y방향 사이에 20% 이상의 차이가 관찰될 것입니다. 일체형 λ/4판을 통해 직선 편광을 원편광으로 전환하면 왜곡 없이 미세 구조를 관찰할 수 있습니다. 검출의 측면에서 볼 때, 샘플에서 방출되는 무작위 형광 편광은 λ/4판의 영향을 받지 않습니다.

그림 10. 직선 편광이 있을 때(a)와 원편광이 있을 때(b)의 형광 비드(Φ 100nm) 형광 이미지. 삽화는 시뮬레이션한 여기광점입니다.
 

결론

Olympus는 Olympus 초고해상도(OSR) 기술과 최적화된 광학 디자인을 기초로 120nm의 공간 해상도를 달성합니다. 이는 공간 해상도가 200nm로 제한되었던 기존 광시야 현미경에 비해 크게 개선된 것입니다. 공간 주파수 이동이나 물체 형태 추정 없이 이미지를 처리할 수 있으므로 신뢰성 높은 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술은 아직 분명하게 드러나지는 않았지만 잠재성이 다분한 분자 동역학에서 유용할 것으로 기대됩니다.

부록
디스크에 있는 컨포칼 핀홀 각각에는 마이크로렌즈가 있어 낮은 레이저 출력에서도 이미징이 가능합니다. 그 결과, 밝은 초고해상도 이미지를 획득하는 동시에 샘플의 광표백 및 광독성은 줄일 수 있습니다². 일반 컨포칼 현미경에서는 조명 점상 강도 분포 함수(PSF)와 검출 PSF에 의해 결상이 이루어집니다. 광축의 D 위치에 있는 핀홀의 결상은 조명 PSF와 검출 PSF에 의해 이루어집니다. 광축의 D/2 위치에서 나오는 정보는 전달되지만 분해되지 않는다는 것을 확인할 수 있습니다. 이를 교정하기 위해 핀홀에 마이크로렌즈를 장착하면 핀홀에 영사되는 개별 초점들이 광학적으로 중앙에 재배치되어 이상적인 이미지가 만들어지고 밝기와 해상도가 높아집니다^6-8. 이런 과정은 핀홀의 크기를 극히 작게 줄인 이상적인 컨포칼 현미경에 필적하는 해상도를 만들어냅니다.

첨부 그림 1. SoRa 디스크 탑재 SpinSR의 원칙과 구성

저자
Dr. Yasuo Yonemaru
광학계 개발
연구개발
Olympus Corporation

참고문헌

1. J. Lopez, et al. “A deconvolution revolution for confocal image enhancement”, BioOptics World, 55, Issue 01, pp. 85–88, January 2019.
2. T. Azuma and T. Kei, "Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment", Opt. Express, 23 (11), pp. 15003–15011, 2015.
3.  (백서) A. Samuelsson, “Silicone Immersion Objectives Answer the Call for Higher Resolution”, (https://www.olympus-lifescience.com/resources/white-papers/silicone_immersion_objectives_for_higher_resolution/)
4. S. Hayashi, "Resolution doubling using confocal microscopy via analogy with structured illumination microscopy", Jpn. J. Appl. Phys., 55 (8), 082501, 2016.
5. S. Hayashi and Y. Okada, "Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics", Mol. Bio. Cell, 26 (9), pp. 1743–1751, 2015.
6. C. J. R. Sheppard, “Super-resolution in confocal imaging”, Optik, 50, pp. 53-54, 1988.
7. C. B. Müller and J. Enderlein, "Image Scanning Microscopy", Phys. Rev. Lett., 104, 198101, 2010. 
8. A. G. York, et al. "Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing", Nat. Methods, 10, pp. 1122-1126, 2013.