Silicone Immersion Objectives Answer the Call for Higher Resolution

굴절률 불일치와 이로 인한 구면수차는 장기적인 고해상도 라이브 셀 이미징에 관심 있는 연구가들을 괴롭혀왔습니다. 실리콘 오일 대물렌즈를 사용하면 이러한 불일치 현상을 완화하는데 도움이 됩니다. 살아있는 세포의 굴절률(n = 1.38)이 전통적인 이멀젼 오일(n = 1.52)나 물(n = 1.33)보다 실리콘 오일(n = 1.4)에 더 가깝기 때문입니다.
이멀젼 매체로 사용되는 실리콘 오일은 광선이 Z의 초점 하나에 모이지 못하는 구면수차를 크게 줄여줍니다. 그 결과, 깊은 샘플 위치에서도 살아있는 세포 및 조직에 대한 밝고 높은 해상도의 3D 이미지를 획득할 수 있게 됩니다. 또한, 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 특히 Z 차원에서 샘플의 실제 형태를 훨씬 더 잘 반영하는 형태 데이터를 산출합니다.

실리콘 vs. 워터/이멀젼 오일

과거에는 라이브 셀 이미징에서 워터 이멀젼 대물렌즈나 글리세롤 이멀젼 대물렌즈를 주로 사용했었습니다. 워터 이멀젼 방식의 경우, 굴절률이 낮으며 주어진 배율에서 높은 개구수(NA)를 갖는 대물렌즈를 개발하는 것이 불가능했습니다. 그 결과, 많은 분야에 요구되는 빛 강도를 충분히 갖지 못하는 이미지가 만들어졌습니다. 그에 반해, 실리콘 이멀젼 대물렌즈의 높은 굴절률은 높은 NA를 갖는 대물렌즈를 생산할 수 있게 해줍니다. 실제로 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 모든 샘플 깊이에서 워터 이멀젼 대물렌즈보다 밝습니다(그림 1). 

그림 1: 60x 대물렌즈의 밝기 비교.
얕은 깊이에서는 오일 이멀젼 대물렌즈가 가장 밝습니다. 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 모든 초점 깊이에서 워터 이멀젼 대물렌즈보다 밝습니다. 

실리콘 이멀젼 오일는 37°C 배양실에서 사용될 때도 사실상 증발현상을 전혀 보이지 않습니다. 연구자가 이멀젼 매체를 주입하기 위해 배양기를 반복적으로 열어야 한다는 점을 고려할 때 이는 워터 이멀젼 대물렌즈에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 이에 따라, 연구자가 지속적인 노력을 기울여야 할 뿐 아니라 샘플이 극적인 온도 및 CO2/O2 변화에 노출되어 샘플의 건강과 생리학이 변하고 초점이 이동하게 될 수도 있습니다.

글리세롤은 흡습성이 높은 물질이기 때문에 주변 환경의 습도에 따라 농도가 쉽게 변합니다. 농도가 변한다는 것은 글리세롤의 굴절률이 쉽게 변할 수 있다는 것을 의미합니다. 

굴절률의 변화는 글리세롤 이멀젼 대물렌즈로 장기간 타임 랩스 이미징을 실시하고자 하는 연구자들에게 커다란 걸림돌이 됩니다. 실리콘은 습도가 변해도 굴절률이 일정하게 유지되므로 이러한 문제를 피할 수 있습니다.

실리콘 이멀젼 대물렌즈의 단점은 전통적인 이멀젼 오일에 비해 점도가 낮다는 것입니다. 표면장력이 낮고 작동거리가 길기 때문에 대물렌즈에서 이멀젼 오일를 정확한 위치에 배치하는 것이 힘든 과제가 될 수도 있습니다. 그러나 이 문제는 워터 이멀젼 대물렌즈만큼 심각하지 않으며 실리콘 오일 비드를 대물렌즈 위에 바로 배치하지 않고 커버 글라스 위에 배치하는 등의 간단하고 다양한 방법을 통해 극복할 수 있습니다. 실리콘 오일 대물렌즈의 가격이 전통적인 워터 이멀젼/오일 이멀젼 대물렌즈보다 높은 것 역시 한 가지 단점이라 할 수 있습니다. 

실리콘 오일 대물렌즈의 응용분야 

그 장점을 고려할 때 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(iPS)의 발생과 분화를 탐구하는 재생생물학과 발생생물학 분야(예: 배아, 제브라피시 및 기타 모형 생물에 대한 거시적/미시적 관찰)에서 특히 유용합니다. 신경생물학에서는 뇌 절편 및 신경세포 배양에 대한 고해상도 이미징에 유용합니다.

실리콘 이멀젼 대물렌즈는 더욱 깊은 심도에서 탁월한 점상 강도 분포 함수를 만들어낼 수 있는 능력 덕분에 몇몇 초고해상도 애플리케이션에도 이상적이며, 오일 이멀젼 대물렌즈를 가뿐하게 능가합니다. 그뿐만 아니라, 비슷한 배율에 대한 높은 NA, 낮은 굴절률 불일치(그림 2), 낮은 증발 현상 덕분에 초고해상도 애플리케이션용 워터 이멀젼 대물렌즈보다도 효과적입니다.

특정한 실리콘 대물렌즈는 최대 1600nm의 파장까지 높은 투과력을 제공하는 특수 코팅이 있어서 다광자 이미징에 이상적입니다. 실리콘 대물렌즈는 Olympus SCALEVIEW-A2(n = 1.38)와 같은 몇몇 투명화제와 비슷한 굴절률을 갖기 때문에 광산란을 줄여 더욱 우수한 해상도의 심층 이미징을 가능케 하는 첨단 투명화 기법에도 적합합니다.

그림 2: 굴절률 불일치가 샘플의 형태에 미치는 영향
정확한 3D 이미지를 만들어내기 위해서는 샘플과 이멀젼 매체의 굴절률을 일치시키는 것이 매우 중요합니다.

3D 라이브 셀 이미징 

일본 긴키대학 유전공학과 부교수 Kazuo Yamagata 박사가 이끄는 연구팀은 실리콘 이멀젼 대물렌즈 덕분에 접합체 내 단백질, DNA 및 기타 분자와 배아 발생기의 개별 세포를 보여주는 선명한 3D 형광 이미지를 얻을 수 있었습니다. 이 연구팀은 접합체 단계부터 배반포 단계까지 생쥐 배아의 체외 발생이 진행되는 약 나흘 동안 실리콘 이멀젼 대물렌즈(Olympus UPLSAPO60XS)를 사용하여 고대비 3D 라이브 셀 이미징을 수행했습니다. 

Yamagata 박사 연구팀은 타임 랩스에 따른 3D 라이브 셀 이미징을 위해 60x 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용했습니다. 이전에는 라이브 셀 이미징 심층 관찰의 표준이었던 오일 이멀젼 렌즈와 워터 이멀젼 대물렌즈를 사용했었으나 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 전환한 후 핵 내부에서 형광 라벨링한 메틸화 DNA(mCherry-MBD-NLS)를 표면부터 내부 구역까지, 세포 접합체 단계부터 배반포 단계까지 모두 확인할 수 있었습니다(그림 3). 

그림 3: 착상 전 발생기 동안의 MethylRO 배아에 대한 라이브 셀 이미징.
핵 내부에서 이루어지는 메틸화 DNA(mCherry-MBD-NLS)의 변화를 약 4일에 걸쳐 관찰했습니다. Olympus 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO60XS를 사용하여 이미지를 획득했습니다. 이미지 제공: Dr. Kazuo Yamagata, 긴키 대학 생물학지향과학학부 유전공학과 부교수

Yamagata 박사의 연구는 장기간 심층 고대비 3D 라이브 셀 이미징을 실현하기 위해서는 실리콘 이멀젼 대물렌즈가 필수적임을 보여줍니다. Yamagata 박사 연구팀은 오랜 관찰 기간 중 초점이 일정하게 유지되고 온도 변화의 영향을 받지 않는 이미지를 획득할 수 있었습니다. 

일본 홋카이도대학 의과대학원 해부학과 소속 연구원 Motokazu Uchigashima(M.D & Ph.D)와 Masahiko Watanabe(M.D & Ph.D)는 60x 오일 이멀젼 대물렌즈로 생쥐 뇌절편 이미지를 획득하여 60x 실리콘 이멀젼 대물렌즈(Olympus UPLSAPO60XS2)로 얻은 이미지와 비교했습니다.

X-Z		X-Y
UPLASAPO60XO （NA: 1.35, W.D.: 0.15mm)
		Z=5μm	Z=35μm, 기준자: 50μm
UPLASAPO60XS2（NA: 1.30, W.D.: 0.30mm)
		Z=5μm	Z=35μm

그림 4: 생쥐 대뇌 신피질 절편에 대한 심층 조직 이미지 비교.

투명화 처리하여 60x 오일 이멀젼 대물렌즈 및 60x 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 촬영한 생쥐 대뇌 신피질 절편 심층 조직 이미지의 비교. 이미지 제공: 홋카이도대학 의과대학원 해부학과 Motokazu Uchigashima(M.D & Ph.D), Masahiko Watanabe(M.D & Ph.D).

생쥐 신피질에 대한 X-Y 이미지는 기존 오일 이멀젼 대물렌즈와 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 촬영했습니다. 두 대물렌즈 모두에서 밝은 형광 이미지를 얻을 수 있었습니다. 그러나 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 이미징했을 때 35μm 심도에서 X-Y 이미지가 분명하게 더 밝았고 해상도도 더 높았습니다(그림 4). 35μm에서 이런 밝기 차가 생기는 이유는 오일 이멀젼 대물렌즈의 구면수차 때문이며, 이는 대물렌즈에 사용한 이멀젼 오일의 굴절률(1.52)과 투명화 용액의 굴절률(1.38)이 달라서 발생하는 것입니다. 여기에서 사용한 실리콘 이멀젼 대물렌즈의 높은 NA와 낮은 굴절률 불일치 현상은 투명화 처리한 샘플의 심층 조직을 관찰하는 동안 탁월한 성능을 제공합니다.

그림 5: 전체 쥐 태반 내 세포 관찰(순차 단층촬영).
이미지 제공: 일본 이화학연구소(RIKEN) 뇌과학연구센터 세포기능역학팀 Asako Sakaue-Sawano(Ph.D) 및 Atsushi Miyawaki(M.D & Ph.D).

일본 이화학연구소(RIKEN) 뇌과학연구센터 세포기능역학팀 소속 Asako Sakaue-Sawano(Ph.D)와 Atsushi Miyawaki(M.D & Ph.D)가 수행한 연구에서, 연구자들은 40x 실리콘 이멀젼 대물렌즈(Olympus UPLSAPO40XS)로 전체 생쥐 태반 샘플에 대한 심층 조직 관찰을 수행했습니다.

낮은 색차

실리콘 이멀젼 대물렌즈와 도립형 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 태반 내 세포를 관찰했습니다. 연구자들은 형태학상으로 온전한 태반 내 세포를 고해상도로 관찰했으며, 조직 절편을 준비할 필요가 없었습니다. 또한 실리콘 이멀젼 대물렌즈의 낮은 색수차 덕분에 유비퀴틴화 기반 세포주기 지표(Fucci)(S/G2/M-녹색, G1-빨간색)와 핵(DAPI-파란색)의 공동 국소화를 정확하게 관찰할 수도 있었습니다(그림 5 및 6). 

그림 6: 태반 세포의 통합 이미지.
이미지 제공: 일본 이화학연구소(RIKEN) 뇌과학연구센터 세포기능역학팀 Asako Sakaue-Sawano(Ph.D) 및 Atsushi Miyawaki(M.D & Ph.D).

Daisuke Kurihara 박사가 이끄는 일본 나고야대학교 ERATO Higashiyama Live-Holonics 프로젝트의 광학기술팀은 최근 식물 접합체 배아 발생 과정에 대한 라이브 셀 이미징에 성공했습니다. 이 연구에서는 실리콘 이멀젼 대물렌즈(Olympus UPLSAPO30XS)를 포함한 새로운 마이크로기기와 특별한 매체가 개발된 덕분에 식물 접합체의 분할과 성장에 관한 장기 라이브 셀 이미징이 가능했습니다(그림 7). 67시간 동안 초기배(4세포 단계)부터 후기배까지의 배발생 과정을 실시간으로 안정적으로 관찰할 수 있었습니다. 

그림 7: 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용한 마이크로 디바이스 이미징의 개략도
전동 XY 스테이지를 사용하여 멀티포인트 타임 랩스 이미징이 획득되었습니다

밑씨 내부에 여러 층의 세포로 덮인 배아에 대한 고감도 이미징이 가능한 현미경과 새로 개발된 밑씨 배양 시스템을 결합한 덕분에 세계 최장 시간 동안 배발생 과정을 실시간으로 관찰할 수 있었습니다. 이 연구에서는 30x 실리콘 이멀젼 대물렌즈(Olympus UPLSAPO30XS)가 탑재된 Olympus IX83 완전 전동형 도립현미경을 선택했습니다. 이 대물렌즈는 넓은 관측 시야를 유지하는 동시에 고화질 심층 이미징을 진행하는데 필요한 높은 개구수(1.05)와 긴 작동거리(0.8mm)를 갖추고 있습니다. 

요약

실리콘 이멀젼 대물렌즈는 높은 NA와 긴 작동거리를 모두 제공하므로 온도 변화의 영향을 받지 않으면서 장기간에 걸쳐 안정적인 고해상도 이미징이 가능합니다. 기존 렌즈에 비해 구면수차가 크게 개선되어 발생학, 재생생물학, 신경생물학, 미생물학 등 다양한 분야에서 진행하는 3D, 라이브 셀 및 심층 조직 이미징에 이상적입니다. 연구자들은 현미경에 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 통합함으로써 최적화된 선명도, 해상도, 재현성을 제공하는 완전한 라이브 셀 이미징 시스템을 구축할 수 있습니다.

*이 글은 Photonics Spectra에 게시되었던 것입니다.

저자
Andrew Samuelsson
Scientific Solutions 부서
OLYMPUS CORPORATION OF THE AMERICAS