What to Consider When Choosing a Microscope Camera

최근 기술이 발달하면서 여러 가지 흥미로운 현미경 검사 전용 카메라가 시판되고 있습니다. 이 글에서는 우수한 품질의 이미지를 만들어내고 관찰과 실험에서 최신 기술의 혜택을 최대화하기 위한 가이드라인으로서, 이러한 카메라에서 사용하는 방법과 기술을 요약하여 설명해 드립니다.

이미지 품질의 핵심 요소

성공적인 현미경 이미징을 위해 가장 중요한 요소는 용도에 적합한 광학계와 카메라를 선택하는 것입니다. 예를 들어, sCMOS(scientific complementary metal-oxide semiconductor) 카메라는 대부분의 형광 이미징을 위한 훌륭한 옵션이지만 생물발광 이미징처럼 노출 시간이 긴 용도에는 부적합합니다. 다음 절에서는 현미경 카메라의 성능 및 용도별 이점과 관련하여 고려해야 할 주요 요소를 상세하게 소개합니다.

해상도: 현미경은 광학적으로 분해하기 어려운 미세한 구조를 관찰하기 위해 이용할 수 있습니다. 이러한 광학적 한계는 화소수가 높거나 픽셀피치가 작아도 반드시 높은 해상도가 만들어지는 것은 아님을 의미합니다. 더 우수한 해상도를 달성하는 열쇠는 개구수(NA), 광학계의 총 배율 및 샘플의 공간 주파수를 고려하여 적절한 픽셀피치를 선택하는 것입니다. 그림 1은 파장이 500nm이고 픽셀피치가 5µm인 이미징 시스템의 반응을 보여주는 변조 전송 함수(MTF) 도해입니다. 그림 1 (a)는 샘플링 주파수의 절반 또는 픽셀피치의 역수인 센서의 나이퀴스트 주파수가 방정식 1에 정의된 광학 차단 주파수보다 낮다는 것을 나타냅니다. 이 경우, 더 높은 해상도를 달성하기 위해 작은 픽셀피치를 시도해볼 수 있을 것입니다. 반면, 그림1 (b)와 (c)에서는 광학계의 점상 강도 분포 함수(PSF)를 보았을 때 샘플에서 나오는 빛이 픽셀피치보다 훨씬 더 넓게 확산되었기 때문에 더 작은 화소의 센서가 더 높은 해상도를 달성할 수 없습니다. 샘플의 공간 주파수 역시 주의 깊게 고려해야 합니다. 산업용 샘플은 종종 날카로운 모서리를 갖습니다. 이는 생물학 샘플보다 공간 주파수가 높으며 더 높은 샘플링 피치가 필요하다는 것을 의미합니다.

그림 1 – PSF와 픽셀피치의 관계를 설명하기 위해 이미지의 화소 배열을 샘플 위에 투영한 MTF 그래프(왼쪽)와 구성도(오른쪽). (a) 10x NA 0.4, (b) 10x NA 0.2, (c) 40x NA 0.9

감도와 노이즈: 신뢰할 수 있는 데이터를 위해서는 높은 신호-노이즈 비율(SNR)이 지극히 중요합니다. 매우 밝은 샘플을 사용하는 몇몇의 경우에는 높은 SNR을 달성하기가 쉽습니다. 그러나 실제는 SNR에 물리적/기술적 한계가 있습니다. 물리적 한계는 센서칩에서 발생하는 광전자 수의 통계적 오차에 기인하며, 이는 샘플의 밝기와 카메라의 감도를 기준으로 판단됩니다. 카메라의 감도는 양자 효율(QE)과 화소 면적으로 표현됩니다. 일반적인 믿음과 달리, QE는 감도를 높이는데 영향을 미치는 유일한 요인이 아닙니다. 픽셀피치는 조금만 높아져도 엄청난 개선 효과를 발휘합니다. 예를 들어, 센서의 픽셀피치를 5.5µm에서 6.5µm로 변경하면 감도가 약 40% 개선됩니다. 반면에 QE를 75%에서 90%로 변경했을 때는 감도가 20%밖에 개선되지 않습니다. QE는 관찰 대상 파장에서 세심하게 확인해야 합니다. 컬러 카메라는 최대 60%의 QE를 가질 수 있습니다. 그러나, 컬러 카메라의 센서에 일반적으로 적용되는 베이어 컬러 필터로 인해 화소의 25%~50%만이 각각의 파장에서 형광을 탐상할 수 있음에 유의해야 합니다.

기술적 한계는 주로 암전류 및 판독 노이즈에 의해 발생하며, 여기에는 전기회로의 전기적 노이즈도 포함됩니다. 오늘날에는 CMOS 및 sCMOS 센서에서 불량 화소를 억제하기 위해 센서 냉각을 이용합니다. 그러나 과거에는 긴 노출 시간 동안 암전류를 억제하려는 방편으로 센서 냉각을 활용했습니다. 단, 노출 시간이 2초 미만인 대부분의 카메라에서는 암전류가 더는 문제가 되지 않습니다. 이러한 한계는 방정식 2와 3으로 표현되며, 짧은 노출 시간에서 SNR을 향상하는 주요 요소는 카메라의 감도와 판독 노이즈라는 것을 보여줍니다. 예를 들어 판독 노이즈가 3e-rms이고 암전류가 0.05e-/s/pixel인 카메라를 사용하는 경우, 2초 미만의 노출 시간에서 암전류가 배경 노이즈에 미치는 영향은 판독 노이즈보다 소수점 둘째자리 정도 더 작습니다.

프레임률: 빠른 프레임률은 실시간으로 이미지를 확인하는 동안 매끄러운 작동을 확보하기 위한 첫 번째 요건입니다. 최근에는 USB 3.0, CMOS 기술 등의 고속 인터페이스 덕분에, 많은 카메라가 초당 30프레임(fps)보다 높은 프레임률과 실용적인 해상도를 갖습니다. 그러나 훨씬 더 높은 프레임률이 필요한 응용 분야가 많이 있습니다. 예를 들어, (1) 빠른 현미경 작동에 발맞출 수 있는 매끄러운 라이브 이미징이 필요한 병리학 자문 및 사례 컨퍼런스, (2) 빠르게 진행되는 생물학적 현상에 대한 고품질 이미징, (3) 광시트 형광 현미경 검사(LSFM)와 같은 용적 관측, (4) 이미지 처리 기반 초고해상도를 포함한 계산 이미징(computational imaging)이 여기에 포함됩니다. 약형광 현미경 검사에는 노출 시간과 관련된 실질적인 한계가 있습니다. 이 문제를 해결하려면, 비닝(binning)이나 다른 이미지 처리 기법을 사용하여 SNR을 개선합니다. 롤링셔터 현상에 의한 이미지 왜곡은 CMOS 센서에 탑재된 빠른 판독 기능의 부작용입니다. 빠르게 움직이는 샘플의 경우, 글로벌 셔터와 글로벌 리셋 기능을 차례로 이용하는 것이 왜곡 현상을 억제하는데 가장 이상적인 솔루션입니다.

다이내믹 레인지: 모노크롬 카메라의 다이내믹 레인지는 아날로그-디지털(AD) 변환 비트 심도가 아닌 이미지 데이터에 대한 전체 비트 심도의 비율로서 bit 단위 판독 노이즈와 비교해야 합니다. 적절한 고급 16bit 카메라를 사용할 경우, 형광 이미징 과정에서 다이내믹 레인지 관련 문제가 드물게 발생합니다. 컬러 카메라의 상황은 다릅니다. 표준 모니터를 사용할 때 컬러 이미지 데이터가 RGB 채널 하나당 8bit로 제한되기 때문입니다. 인간의 눈은 지속적으로 밝기에 적응하는 능력이 있어서 더 큰 다이내믹 레인지를 갖는다는 점을 고려할 때 8bit는 충분하지 않습니다. 우수한 이미지 품질의 열쇠는 인간 눈의 반응에 일치하도록 설계된 대비 곡선에서 찾을 수 있습니다(그림 2).

그림 2 - 잘 설계된 대비 곡선을 갖는 이미지의 예(왼쪽)에서는 투명하고 밝은 세포와 어둡게 층을 이룬 세포를 확인할 수 있습니다. 제대로 설계되지 않은 대비 곡선을 갖는 이미지(오른쪽)는 그렇지 않습니다.

관측 시야(FOV): 어떤 카메라들은 대형 이미지 센서가 탑재되어 있어서 1X 카메라 어댑터를 사용할 때조차도 대각선 범위가 18mm보다 큰 FOV를 제공할 수 있습니다. 상대적으로 작은 센서가 탑재된 카메라들은 1X 미만의 배율을 갖는 카메라 어댑터를 사용하여 넓은 FOV를 달성합니다. 그러나 음영 및 광학 수차와 관련된 문제가 제기되며, 광축으로부터 사선 방향으로 18mm 이상 이동할 때(그림 3) 및 이미지 정합을 시행할 때(그림 4) 문제가 특히 심각합니다.

그림 3 - FOV 크기에 따른 광강도의 평탄도를 보여주는 구성도 일반적으로, 저배율 어댑터나 대형 센서를 사용하여 만들어낸 넓은 FOV(B)는 작은 FOV 구성(A)보다 평탄도가 열악합니다. 평탄도는 대물렌즈 및 광학 구성에 따라 크게 달라집니다.

그림 4 - 이미지 정합(오른쪽) 시 음영(광강도의 불균일성)이 두드러지게 나타나지만 개별 FOV 이미지(왼쪽)에 비해 약합니다.

색 재현: 인간의 눈은 카메라 센서와 다르게 스펙트럼에 반응합니다. 그러므로 카메라 판매사는 인간이 현미경 접안렌즈를 통해 관찰하는 것과 비슷한 색상을 모니터에서 구현하기 위해서 여러 가지 기법을 사용해야 합니다. 색을 제대로 재현하기 위한 첫 단계는 적절한 화이트 밸런스(WB)를 만들어내는 것입니다. 명시야(BF) 관측 전용의 자동 WB 기능은 살아있는 BF 이미지에서 “흰색” 배경을 자동으로 탐지하므로 수동 조작에 따른 시간 소모를 줄여줍니다. 높은 색 충실도를 달성하기 위해, 센서에서 나오는 RGB 신호를 모니터 위에서 R’G’B’ 신호로 전환하는 컬러 매트릭스가 이미지 처리에 포함됩니다. 그러나 이 과정은 독립된 축의 개수로 제한되며, 예를 들어 DAB로 착색한 갈색에서 에오신으로 착색한 적색을 독립적으로 조정할 수 없습니다. 두 색상 모두 적색 신호를 담고 있기 때문입니다. 다축 색 조정은 이러한 한계를 극복하고 다양한 착색제에 대해 최적화된 색을 제공하는 한 가지 방법입니다(그림5). 색 공간과 모니터와의 색맞춤도 중요합니다. Adobe RGB 색 공간은 더 넓은 범위의 색을 표현할 수 있으며 Masson trichrome 염색과 같은 선명한 녹색에 특히 유익합니다. 그러나 Adobe RGB 모니터용 이미지 데이터는 적절한 ICC 프로파일 교환 없이는 다른 sRGB 모니터에 표시할 수 없습니다.

그림 5 – 기존 색 조정의 경우 에오신의 적색 강화(좌측)가 다른 모든 착색제에 영향을 미치는 반면, 다축 색 조정(우측)은 각 착색제에 대해 색의 독립적 최적화를 가능하게 합니다.

지금까지 언급한 모든 핵심 요소는 독립적이지 않습니다. 특히, 해상도와 감도, 프레임률, FOV는 상호연관성이 높습니다. 샘플에서 한 영역을 관찰할 때 픽셀피치가 작으면 해상도는 높아지고 감도는 감소합니다. 반면, 저배율 카메라 어댑터는 낮은 해상도와 높은 감도, 넓은 FOV를 제공합니다. 준비 과정에서 광독성으로 인해 샘플이 손상되는 것을 피하려면 비닝(binning)을 통해 노출 시간을 줄이고 프레임률을 높이면 도움이 될 수 있습니다. 비닝(binning) 기법을 사용하면 해상도가 약간 저하되는 것이 사실입니다. 그러나 실험 준비 단계에서는 해상도의 중요성이 비교적 낮습니다.

이미지 처리 및 기능 이미징

몇몇 응용 분야에서는 전통적인 광학적·물리적 한계를 넘어서기 위해서 이미지 처리를 이용합니다. 확장 초점 이미지(EFI) 기법은 하나의 이미지에서 두꺼운 샘플을 얻기 위해 이용할 수 있으며(그림 6), 실체현미경에서 특히 유용합니다. HDR(High Dynamic Range) 이미징은 반사 샘플을 캡처할 수 있는 능력 덕분에 산업 검사에 종종 사용됩니다(그림 7). 형광 라이브 이미지의 SNR은 여러 기법으로 개선할 수 있습니다. 예를 들어, 현미경 스테이지가 정지되어 있을 때만 기능하는 자동 멀티프레임 평균은 빠른 프레임률과 높은 SNR을 달성하는 동시에 샘플의 광독성 손상을 최소화합니다.

그림 6 – EFI: EFI 미적용(왼쪽), EFI 적용(오른쪽)

그림 7 – HDR: HDR 미적용(왼쪽), HDR 적용(오른쪽)

결론

이미지 품질은 그 핵심 요소 사이의 상호연관성이 높기 때문에 복잡한 주제입니다. 최상의 방법은 구체적인 현미경 관찰에서 가장 중요한 요건을 기준으로 현미경 카메라 선택 결정을 내리는 것입니다. 매우 다양한 카메라 옵션이 시판되고 있으므로 사용자가 각 요소의 균형을 맞추어 시스템을 구축할 수 있습니다. 사양명세서에 표기되어 있지 않은 성능 차이 및 복잡성을 고려할 때, 구매 전에 철저한 평가를 거친 후 응용 분야에 적합한 카메라를 결정해야 합니다. 응용 분야에 적합한 광학계와 카메라를 선택하면 더 많은 데이터와 더 높은 이미지 품질을 얻을 수 있으며, 첨단 이미지 처리를 통해 현미경 이미징의 전통적인 한계를 뛰어넘을 수 있습니다.

저자
Takeo Ogama
Scientific Solutions Division
OLYMPUS CORPORATION OF THE AMERICAS