경사 대비 방법 소개

1. 서문

광학 현미경은 16세기에 발명된 후 미생물과 적혈구의 발견 등 생물학 연구에 크게 기여해 왔습니다. 19세기에는 표본 염색 기술이 발달하여 투명한 구조를 색 조영제로 염색하여 더 쉽게 볼 수 있게 되었습니다. 안타깝게도, 염색제는 독성이 있기 때문에 살아 있는 표본에는 사용이 제한됩니다. 20세기부터 염색되지 않은 투명한 개체를 보는 방법(예: 위상차 현미경)이 다양하게 개발되어 오늘날까지 생물학 연구에 없어서는 안 될 도구가 되고 있습니다.

2. 위상차 방법의 변화

염색되지 않은 투명한 개체를 보기 위한 일반적인 위상 시각화 방법은 그림 1에 각 광학 소자 배열과 함께 간략하게 설명되어 있습니다. 기존의 위상 시각화 방법은 집광기 동공과 대물렌즈 동공에 각각 특정 광학 소자를 배치하여 구현됩니다.

위상차 방법(그림 1a)에서는 링 조리개가 있는 전용 집광기 렌즈와 위상막 링을 포함한 전용 대물렌즈를 조합하여 사용합니다. 집광기의 링 조리개를 통과하는 광선 중 표본을 직접 통과하는 광선은 대물렌즈 동공의 위상막을 통과합니다. 반면에 표본에 의해 편향된 광선은 위상막 외부를 통과하여 두 성분이 서로 간섭하는 지점에서 명암의 대비를 만듭니다. 이 프로세스의 독특한 특징은 표본의 굴절률 분포가 변하는 단계에서 후광이라고 하는 밝은 얼룩이 나타난다는 것입니다. 두꺼운 샘플은 후광이 너무 강하게 나타나기 때문에 이 방법에 적용하기에 적합하지 않습니다.

미분 간섭 대비 방법(그림 1b)은 집광기 동공과 대물렌즈 동공 위치에 보완적인 월라스톤 프리즘이 있는 편광 전단 간섭계입니다. 표본 이미지는 고정된 방향으로 약간 이동한 이중 이미지가 되고 샘플의 굴절률 단계가 음영 처리되어 3차원적으로 나타납니다. 편광 간섭을 이용하기 때문에 플라스틱 페트리 접시나 광학 경로에 편광 왜곡을 일으키는 기타 물체가 있으면 관찰이 불가능합니다.

변조 대비 방법(그림 1c)은 집광기 동공의 슬릿 개구부를 사용하여 조명 빔이 한 방향으로만 향하도록 제한합니다. 조명 빔을 가이딩하면 표본에서 조명의 직선 부분이 회색으로 표시되고 굴절된 부분의 대비는 대물렌즈 동공의 변조기 덕분에 굴절 방향에 따라 변합니다. 조명의 일부를 투과하거나 차폐하면 미분 간섭 대비 방식 이미지와 유사한 3차원 이미지를 얻을 수 있습니다. 변조 대비 방법에서는 편광을 사용하지 않으므로 페트리 접시 같은 플라스틱 용기를 사용할 수 있습니다. 그러나 이 방법을 사용하면 해상도가 약간 떨어집니다. 조명 빔의 방향을 제한하면 조명 개구수(NA)가 작아지기 때문입니다.

그림 1. 다양한 위상 시각화 방법의 광학 장치 배열

다양한 위상 시각화 방법에 필요한 광학 요소. a. 위상 대비 방법, b. 미분 간섭 대비 방법, c. 변조 대비 방법, d. 경사 대비 방법.

3. 경사 대비 방법

경사 대비 방법(그림 1d)은 미분 간섭 대비 방법과 유사한 의사 3차원 이미지를 생성하는 것이 특징입니다. 다른 위상 시각화 방법은 염색되지 않은 표본에서 대비를 생성하기 위해 여러 광학 구성 요소가 필요하지만, 경사 대비는 대물렌즈 동공에 기울어진 ND 필터를 삽입하기만 하면 구현할 수 있습니다.

경사 대비 방법의 원리

대물렌즈의 동공 위치에 삽입된 기울어진 ND 필터는 한 방향으로 투과율이 단조롭게 감소합니다. 대물렌즈의 동공 위치에 투사된 집광기 렌즈의 조리개 지름은 대물렌즈의 동공 지름에 비해 어느 정도 줄어듭니다. 샘플의 굴절률 분포가 평평하면 집광기 렌즈의 조리개 이미지가 대물렌즈 동공의 중심 위치에 투영되고 이후, 기울어진 ND 필터 중심 근처의 투과율에 의해 영향을 받습니다(그림 2a). 샘플의 굴절률 분포에 경사가 있으면 집광기 렌즈의 조리개 이미지가 기울어진 ND 필터의 중심에서 이동하므로, 조명 빔이 샘플 위치에서 굴절되면 기울어진 ND 필터에 의한 전체 투과율이 변경됩니다(그림 2b 및 c). 따라서 샘플 굴절률의 기울기에 해당하는 밝기로 이미징되며 샘플의 굴절률 분포가 3차원적으로 보입니다(그림 2d).

집광기 렌즈의 조리개는 구경 조리개를 사용하여 조정할 수 있습니다. 조리개 크기가 상대적으로 크면 샘플의 굴절률 기울기로 인한 밝기 변화가 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 이미지 센서로 캡처한 이미지가 강조되어 보기 쉬운 대비로 표시됩니다.

그림 2. 경사 대비 방법의 원리에 대한 그림

경사 대비 방법에 의한 위상 개체의 명암 대비 원리에 대한 설명. a. 샘플의 위상 분포가 편평하면 광선이 직선으로 진행하여 경사 ND 필터의 중심 근처를 통과합니다. b, c. 샘플의 위상 분포가 기울어진 경우, 경사 방향이 경사 ND 필터의 밝은 부분(b)을 통과하거나 어두운 부분(c)을 통과하도록 광선이 굴절됩니다. d. 관찰 이미지가 샘플 위상 분포의 경사 방향에 따라 명암의 대비로 관찰됩니다.

경사 대비 방법의 특징

경사 대비 방법으로 생성된 위상 이미지는 기존의 위상 시각화 방법에 비해 많은 장점이 있습니다. 경사 대비 방법은 위상 대비 방법과 달리 후광이 발생하지 않기 때문에 두꺼운 샘플에 적용할 수 있습니다. 경사 대비 방법은 미분 간섭 대비 방법과 달리 편광 기반이 아니므로 플라스틱 용기를 통해서도 표본의 의사 3차원 이미지를 잘 생성할 수 있습니다. 그리고 조명의 개구수가 다른 방법보다 크기 때문에 물방울이 있는 페트리 접시 뚜껑을 통한 이미징에서 발생하는 문제에 덜 취약합니다. 또한 이 기능은 변조 대비 방식에서 차폐 소자를 사용하여 발생하는 해상도 저하를 방지합니다. 또 다른 실용적인 이점은 대물렌즈 전환 시 전용 대물렌즈나 스위칭 소자가 필요하지 않아 더 쉽고 빠르게 관찰할 수 있다는 것입니다.

경사 대비 방법을 위한 광학 장치 구성

APX100 이미징 시스템의 광학 장치 구성은 그림 3에 나와 있습니다. 조명은 광학 경로를 통해 표본에 조사되어 이미징 표면에서 이미징됩니다.

기울어진 ND 필터는 대물렌즈의 동공 위치와 결합된 위치에 배치됩니다. 이 필터는 시스템이 경사 대비 방법으로 설정된 경우에만 광학 경로에 들어갑니다. 집광기의 개구부 직경은 대물렌즈의 배율과 동공 직경에 따라 최적의 값으로 자동 조절됩니다.

그림 3. 염색되지 않은 샘플의 경사 대비 관찰을 위한 APEXVIEW™ APX100 벤치톱 형광 현미경의 광학 구성

경사 대비 적용

아래를 보면, 용기 1과 2의 Hela 세포를 10배율 대물렌즈로 관찰하고 앞서 설명한 4가지 관찰 방법을 사용하여 이미지를 캡처하여 이미지를 비교할 수 있도록 했습니다.

1. 유리 바닥 접시 ※플라스틱 뚜껑이 닫혀 있음
2. 12웰 마이크로플레이트 ※물방울이 플라스틱 뚜껑에 붙어 있음

결과 비교:

1. 경사 대비 이미지는 위상 대비 및 변조 대비 이미지와 비슷합니다. 미분 간섭 대비 이미지에서는 플라스틱 뚜껑으로 인해 편광 성능이 저하되어 대비가 낮습니다.
2. 다른 관찰 방법과 비교하여 경사 대비 이미지는 시야가 더 고르고 대비가 좋습니다. 조명의 개구수는 다른 관찰 방법에 비해 크고 표본의 이물질과 용기의 물방울의 영향을 덜 받습니다.

4. 요약

경사 대비 방법은 대물렌즈 동공에 하나의 경사 ND 필터만 추가하면 되는 간단한 광학 구성을 사용하는 위상 개체 관찰 방법입니다. 이 방법은 염색되지 않은 살아 있는 표본을 관찰하는 데 적합합니다. 기존 위상 개체 관찰 방법과 비교하여 경사 대비 방법의 장점은 다음과 같습니다.

• 두꺼운 표본에도 잘 작동
• 플라스틱 페트리 접시에 있는 표본에 효과적으로 적용
• 페트리 접시의 뚜껑을 통해 관찰할 수 있으므로 배양된 세포에 대한 오염 위험이 줄어듦
• 전용 대물렌즈 불필요
• 대물렌즈 전환 시 소자 전환이 불필요

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