다광자 형광 현미경 검사 소개

다광자 형광 현미경 검사는 레이저 스캐닝 현미경 검사의 고급 광학 기술과 장파장 다광자 형광 여기를 결합하여 매우 특정한 형광단으로 태그가 지정된 표본의 고분해능 3차원 이미지를 캡처하는 강력한 연구 도구입니다.

그림 1.다광자 여기 형광 현미경 구성

이 방법론은 표본에 상당한(그리고 보통 치명적인) 손상을 입히지 않으면서 생세포와 조직의 동적 프로세스를 연구하려는 세포 생물학자에게 특히 유용합니다.전형적인 광시야 형광 현미경 검사는 흔히 생체에서 생화학적 이벤트에 대해 1미크론 미만 분해능을 제공할 수 있지만, 이 기술은 초점면 위와 아래에 위치한 영역 전체에서 2차 형광으로 인한 배경 노이즈 때문에 감도와 공간 분해능이 제한됩니다.

다광자 현미경 검사의 여기는 회절 제한 현미경의 초점에서만 발생하여, 3차원 분해능을 얻을 수 있도록 두꺼운 생물학적 표본을 광학적으로 절단하는 기능을 제공합니다.개별 광학 단면은 x-y 평면에서 표본을 래스터 스캔하여 획득하고 전체 3차원 이미지는 순차적인 z 위치에서 표본을 연속 스캔하여 구성합니다.다광자 형광은 초점 위치를 정확하게 결정하고 제어할 수 있기 때문에 표본 표면 아래의 선택 영역을 조사하는 데 유용합니다.고도로 국지화된 여기 에너지는 표본에 부착된 형광단의 광표백을 최소화하고 광손상을 줄여 세포 생존력을 증가시키고 생세포의 특성을 조사하는 후속 실험 기간도 늘립니다.또한 근적외선 여기 파장을 적용하면 생물학적 물질에 더 깊이 침투할 수 있고 단파장에서 관찰되는 높은 수준의 광산란을 줄일 수 있습니다.이러한 장점 덕분에 연구원들은 생체 내 살아 있는 동물의 뇌 절편 또는 살아 있는 뇌 같은 살아 있는 두꺼운 조직 샘플을 대상으로 실험할 수 있으며 다른 현미경 검사 기술로는 이미징하기 어려운(불가능하지는 않더라도) 배아를 발달시킬 수 있습니다.

그림 1은 다광자 형광 현미경 검사 실험에 사용되는 일반적인 구성을 보여줍니다.현미경은 생체 내에서 작은 실험 동물의 살아 있는 조직을 관찰하도록 설계된 직립형 기기입니다.현미경 본체 뒷면은 티타늄-사파이어 모드 고정 펄스 레이저 시스템으로, 피크 강도는 높지만 평균 출력은 낮아 다광자 여기에 대해 선호되는 광원 중 하나입니다.필터링된 광전자 증배관 검출 시스템은 현미경의 노즈피스에 충분히 가까운 위치에 연결되어 대물렌즈가 효과적으로 캡처한 산란된 형광을 검출합니다.현미경으로 수집한 디지털 이미지는 함께 제공되는 컴퓨터 워크스테이션에서 처리 및 분석되며, 여기에서 광학 단면의 3차원 구성을 재조립할 수 있습니다.

기존 광시야 형광 현미경 검사는 초점 영역으로부터 멀리 떨어진 곳에서 발생하는 2차 형광 때문에 어려움을 겪습니다. 플레어와 높은 배경 노이즈 신호를 야기하여 중요한 표본 세부 정보를 보지 못하게 되는 경우가 많기 때문입니다.공초점 현미경 검사는 핀홀 조리개를 사용하여 초점이 맞지 않는 배경 형광을 차단하는 방식으로 이 문제를 대부분 피해 갑니다. 핀홀 조리개는 두꺼운 표본의 깊은 곳에서 흐려지지 않은 얇은(1미크론 미만) 광학 단면을 생성합니다.다광자 형광 현미경 검사는 선택적 여기와 더 넓은 검출 범위란 선택지를 모두 갖추어, 공초점 현미경 검사의 대안이 됩니다.기존 공초점 현미경과 달리 그림 1에 표시된 현미경은 검출기 근처에 핀홀이 없어도 3차원 식별이 가능하므로 방출된 형광 신호의 효율을 획기적으로 높입니다.이전에는 다광자 여기에 필요한 펄스 레이저 시스템의 비싼 비용과 높은 복잡성 때문에 이 기술을 사용하는 데 제약이 있었습니다.요즘에는 턴키 레이저 및 상업용 다광자 시스템 덕분에 많은 검사에서 다광자 형광 현미경 검사를 선택하게 되었습니다.

이광자 및 삼광자 여기

다광자 여기의 기본 원리는 Maria Göppert-Mayer, Ph.D가 70여 년 전 박사 학위 논문 연구를 수행하면서 처음으로 설명되었으나, 약 30년이 지나 펄스 루비 레이저가 발명된 후에야 비로소 확인되었습니다.높은 광자 밀도에서 이광자는 에너지를 결합해 형광단을 여기 상태로 바꾸는 전자 전이를 유발하여 동시에 흡수될 수 있습니다(가상 에너지 준위에 의해 매개됨).광자의 에너지는 그 파장에 반비례하기 때문에 이광자는 단광자 여기에 필요한 파장보다 약 두 배의 파장을 가져야 합니다.예를 들어, 파장이 640나노미터(적색광)인 이광자는 결합하여 320나노미터 영역(자외선)에서 자외선 흡수 형광단을 여기시킬 수 있으며, 이렇게 되면 더 긴 파장의 2차 형광(청색 또는 녹색)이 방출됩니다.이 특별한 방식은 적외선 영역으로 확장되는 더 긴 파장을 단일 양자 이벤트에서 발색단을 여기시키는 데 편리하게 활용할 수 있으며 이후 더 낮은 파장에서 2차 방사선이 방출됨을 의미합니다.

각 여기 이벤트에 이광자가 필요하므로 속도 상수가 여기 강도의 제곱에 따라 달라집니다.다광자 여기를 유도하기 위해 광자가 동일한 파장이어야 할 필요는 없지만 대부분의 실험 시스템은 단일 레이저 광원으로 설계되므로 이광자는 일반적으로 좁은 파장 분포를 갖춘 정의된 모집단의 구성원입니다.단광자 흡수의 경우와 달리, 지정된 형광단이 이광자를 동시에 흡수할 확률은 입사 광자 사이의 공간적 및 시간적 중첩 둘 모두와 함수 관계에 있습니다.각 형광단이 동일한 레이저 단면에 노출된다는 가정을 기반으로 하는 계산은 광자가 서로 10(-18)초(1아토초) 이내에 도착해야 함을 나타냅니다.이 중첩 기간의 시간 척도는 중간 가상 준위의 수명(10(-17)초 또는 0.01펨토초)과 일치합니다.

충분한 수준의 형광단 여기를 보장하려면 다광자 형광에서 광자 밀도가 높아야 합니다.사실, 광자 농도는 동일한 수의 단광자 흡수를 위해 필요한 농도의 약 백만 배여야 합니다.이 농도는 고출력 모드 고정 펄스 레이저를 통해 가능합니다. 이 레이저는 펄스 피크 중에 상당한 양의 출력 레이저를 생성하지만 평균 출력이 표본을 손상시키지 않을 만큼 충분히 낮습니다.레이저에서 방출되는 짧지만 강렬한 펄스는 일정한 평균 입사 레이저 출력 수준에서 특정 형광단에 대한 평균 이광자 흡수 확률을 높입니다.평균 여기 출력 수준을 최소화하면 여기 중에 표본에서도 발생하는 단광자 흡수의 양이 줄어듭니다.형광 실험 중에 발생하는 대부분의 가열 및 일부 광손상을 유발하는 것은 단광자 여기 이벤트입니다.

일반적인 펄스 레이저 구성은 다광자 형광 실험을 위해 80~100MHz의 반복 속도로 약 100펨토초(10e(-13)초)의 짧은 충격 계수를 사용합니다.이 체계에서는 표본이 과도한 양의 열과 광손상을 받지 않으면서 만족스러운 이미지 획득이 가능합니다.각 펄스의 시간 척도는 흔히 "매우 짧다"라고 하지만 여전히 이광자 흡수에 대한 반응 시간보다 4~5배 더 깁니다.이광자 펄스에 의해 여기된 발색단의 단일항 상태 모집단은 기존 광시야 또는 공초점 형광 현미경 검사에서 얻은 것과 동일합니다.따라서 이광자 여기 후 2차 형광 방출은 단광자 실험에서 관찰된 것과 구별되지 않습니다.로다민 같은 형광단은 단광자 여기 이벤트에 의해 여기되었든 이광자 여기 이벤트에 의해 여기되었든 간에 동일한 넓은 파장 범위의 2차 형광을 방출합니다.

삼광자 여기는 이광자 여기와 유사한 방식으로 발생할 수 있는 관련 비선형 광 흡수 이벤트입니다.차이점은 여기된 단일항 상태로 전이되는 것을 막기 위해 삼광자가 형광단과 동시에 상호 작용해야 한다는 것입니다.삼광자 여기의 이점은 흡수에 성공하려면 이광자 흡수에 비해 10배 더 많은 광자 농도만 필요하기 때문에 일부 실험에서 이 기술이 매력적이라는 것입니다.이광자 흡수에 비해 삼광자 여기는 z축 분해능을 훨씬 더 향상시킬 수 있습니다.이는 3개의 개별 광자와의 동시 상호 작용이라는 요건으로 인해, 형광단 여기의 단면이 더 작기 때문입니다.실제로 1,050나노미터를 중심으로 파장 분포를 가진 레이저 방출 적외선은 자외선 영역(약 350나노미터, 여기 파장의 1/3)에서 흡수하는 형광단을 여기시킬 수 있습니다.동일한 레이저는 이중 표지된 생물학적 실험에서 유용한 조합인 반파장(525나노미터)에서 다른 형광단을 동시에 여기시킬 수 있습니다.

삼광자 형광은 더 짧은 근적외선 파장(720나노미터까지)을 활용하여 유용한 형광 이미징 범위를 심자외선으로 확장할 수 있습니다.900~700나노미터 범위의 레이저 파장은 기존 현미경 광학 장치를 사용해서는 사실상 접근할 수 없는 240~300나노미터 영역에서 흡수하는 형광단을 여기시킵니다.형광 대물렌즈 제조에 사용되는 유리는 300나노미터 미만의 파장에 대해 투과율이 매우 낮지만, 더 긴 파장의 적외선 레이저 방사선은 쉽게 통과하여 삼광자 여기를 생성할 수 있습니다.

일반적인 방향족 아미노산인 트립토판의 단광자, 이광자 및 삼광자 여기가 그림 3에 개략적으로 설명되어 있습니다.4.5전자볼트 단광자 전자 전이는 280나노미터에서 트립토판을 여기시키고 자외선 영역의 348나노미터에서 2차 형광을 후속 방출합니다.이광자 메커니즘에 의한 여기는 580나노미터를 중심으로 한 녹황색광으로 이루어지며, 삼광자 여기는 아미노산이 근적외선 영역에서 840나노미터 방사선으로 조명될 때 발생합니다.전이는 자브론스키 다이어그램(그림 3)에 표시되어 있는데, 여기에서 가상 준위는 이광자 여기의 경우 한 개의 구체로 표시되고 삼광자 여기의 경우 두 개의 구체로 표시됩니다.트립토판은 다른 방향족 아미노산보다 높은 양자 수율로 훨씬 더 강한 형광을 가지며 대부분의 단백질에 소량만 있습니다.이러한 특성으로 인해 다광자 현미경 검사는 트립토판 잔류물의 자가형광을 사용하는 조사에서 훌륭한 도구가 됩니다.사광자 여기를 포함하여 더 높은 차원의 비선형 현상이 가능하지만 아직 생물학적 연구에 적용되지는 않았습니다.

이광자 형광 현미경 검사

다광자 현미경 검사에서 초점을 바로 둘러싸고 있는 영역으로 여기를 국지화하는 현상은 이곳에 광자 밀도가 가장 높기 때문에 발생하는 것입니다.이 장점은 형광단에 의한 이광자 흡수가 여기 강도의 제곱의 함수라는 기초 물리 원리에서 발생합니다.펄스 레이저 광원의 광자가 높은 개구수의 대물렌즈로 초점이 맞춰지면 광자가 더 과밀하게 되어 광원 둘 이상이 단일 형광단과 동시에 상호 작용할 가능성이 커집니다.현미경 초점이 상당한 여기가 발생하는 유일한 영역이므로 이곳의 광자 농도는 다광자 흡수에 매우 중요합니다.이 개념은 그림 2와 4에 표시되어 있으며 각각 거시적 수준과 미시적 수준에서 다광자 여기를 보여줍니다.그림 2는 현미경 슬라이드와 커버슬립에서 배양된 세포를 이미지화하는 위치에 있는 현미경 대물렌즈의 확대된 보기를 보여줍니다.적색 레이저 펄스는 대물렌즈의 세로축을 가로지르고 그림의 중앙 부분에 있는 세포에 집중되고 초점이 맞춰집니다.

그림 4에서 광자 과밀 및 형광단과의 상호 작용은 현미경 초점에서 드러납니다.적색 레이저 광의 펄스가 형광단(구체의 선형 삼중항으로 표시됨)을 포함하는 표본을 통과할 때 펄스가 대물렌즈의 초점에 도달하면서 여기 확률이 높아집니다.개별 광자는 레이저 펄스의 경계를 정의하는 확산 적색 선으로 분리된 집계로 표시됩니다.그림 4의 초점 영역 중앙에 위치한 작은 그룹의 형광단 분자는 이광자의 동시 흡수에 의해 여기되었으며 녹색 2차 형광을 보여줍니다.이 영역에서는 광자 밀도가 충분히 높지 않기 때문에 초점면 외부의 발색단이 이광자를 흡수할 확률은 거의 없습니다.

이광자 여기 현상이 가능한 것은 현미경 초점에서 형광단의 공간적 근접성 때문만이 아니라 순차적인 레이저 펄스에 포함된 광자의 시간적 중첩 때문이기도 합니다.위에서 언급한 바와 같이, 이광자 흡수에서 여기 에너지는 레이저 광원에 의해 생성된 광자 강도의 제곱에 비례하여 발생합니다.펄스 레이저 빔 강도는 초점면에서 거리의 제곱으로 떨어지므로 초점 영역 근처 형광단의 여기 확률은 초점면에서 형광단 거리의 4제곱으로 감소합니다.펄스 레이저 조명 원뿔의 치수는 대물렌즈 개구수에 의해 결정됩니다.따라서, 초점에서 먼 빔 강도 감소는 여기광 원뿔 직경의 제곱에 비례합니다.조명 원뿔이 초점 위아래로 확장됨에 따라 형광단 여기 확률은 원뿔 직경의 4제곱으로 감소합니다.이러한 이유로, 형광단 여기는 전체 표본의 매우 얇은 광학 단면만을 나타내는, 초점을 둘러싼 인접 영역으로 제한됩니다.

일반적으로 약 100펨토초~1피코초(10e(-13)~10e(-12)초) 범위의 레이저 펄스 지속 시간은 거시적 측면에서 매우 짧다고 간주됩니다.그러나 광자 흡수 이벤트의 시간 척도 면에서(약 1/1000 펨토초) 펄스 지속 시간은 실제로 상당히 깁니다.이렇게 되면 형광단 포화가 제한되고 여기가 한 차례 다시 발생하기 전에 분자가 펄스 사이의 기저 상태로 돌아갈 수 있는 충분한 시간이 생깁니다.펄스 반복 속도 범위는 약 80~120MHz로, 여기를 위한 높은 순간 피크 출력 및 평균 10나노초의 드웰 시간을 제공합니다.일반적인 형광단의 형광 수명은 몇 나노초에 불과하기 때문에 여기된 분자 모집단은 펄스 사이에서 진정될 시간이 충분합니다.상대적으로 짧은 펄스 충격 계수(펄스 지속 시간을 펄스 사이의 시간으로 나눈 값)는 평균 입력 레이저 출력을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사에 일상적으로 사용되는 값보다 약간 더 큰 값으로 제한합니다.

초점면 근처 영역에 대한 이광자 여기의 제한은 공초점 현미경 검사보다 다광자에 상당한 이점을 제공합니다.형광은 공초점 현미경 검사에서 표본 전체에 여기되지만 검출기에 의해 수집된 이차 형광은 공초점 핀홀에 의해 대물렌즈 초점면으로 제한됩니다.이렇게 되면 데이터에 배경 노이즈를 더하는 다른 초점면의 배경 노이즈 또는 형광의 양이 줄어듭니다.그에 반해, 다광자 현미경 검사에서는 초점면에서만 형광 여기를 생성(그리고 이후에 형광 방출)하여 배경 신호와 공초점 핀홀의 필요성을 모두 없앱니다.공초점 및 다광자 현미경 검사에서 여기 모드 사이의 극적인 차이는 각 기술에 대한 광표백 프로파일을 살펴볼 수 있는 그림 5에 설명되어 있습니다.

그림 5에 표시된 것은 형광단 로다민(녹색 염색)으로 염색된 폼바 고분자 필름에서 단일 x-y 평면을 반복적으로 스캔하여 발생하는 x-z 광표백 패턴입니다.왼쪽(그림 5(a))에는 공초점 현미경으로 염색된 필름을 스캐닝하여 생성한 프로파일이 있습니다.스캔 중앙의 흰색 사각형은 핀홀을 통과하고 검출기에 의해 이미지화되는 초점면을 나타냅니다.사각형의 위쪽 및 아래쪽 모서리에서 돌출된 청색 대각선은 여기광 빔이 필름을 통과하는 광 경로를 나타냅니다.빔 래스터가 필름을 스캔하면 형광 염료가 여기되어 2차 형광을 방출합니다.결국, 광표백이 발생하고, 초점 영역의 어두운 영역으로 표시됩니다.공초점 현미경으로 스캔한 필름(그림 5(a))에서 통합 여기는 초점면 위와 아래의 여기 경로 전체에서 거의 동일합니다.반대로, 다광자 현미경에 의해 생성된 x-z 반복 스캔 여기 프로파일은 여기와 광표백을 초점면으로 제한합니다(그림 5(b)).그림 5(a)의 경우와 마찬가지로, 초점면에서 나오는 청색 대각선은 여기광이 초점면에 도달하는 경로를 나타냅니다.

다광자 현미경 검사가 제공하는 국지화된 여기에서 많은 이점이 발생합니다.아마도 가장 중요한 이점은 이 기술로 달성할 수 있는 높은 수준의 3차원 분해능일 것입니다. 이 분해능은 이상적인 공초점 현미경으로 얻은 것과 동일합니다.또한, 초점면 외부에 위치한 형광단의 흡수 부족으로 인해 더 많은 여기광이 표본을 통과하여 초점면에 도달할 수 있습니다.그 결과 집속 빔의 능력이 극적으로 증가해, 공초점 현미경 검사로 관찰한 것보다 2~3배의 깊이까지 표본 내 깊숙이, 자주 침투합니다.

앞서 설명한 바와 같이, 초점 영역 외부의 다광자 흡수 확률은 광축(z 방향)을 따라 거리의 4제곱으로 떨어집니다.형광단의 균일한 분포가 개구수가 높은(1.4) 대물렌즈로 다광자 여기의 영향을 받으면 흡수의 약 80%가 초점 부피라고 하는 엄격하게 정의된 공간에서 발생합니다.이 부피의 치수는 대물렌즈 개구수에 따라 다르지만 근적외선 파장에서 일반적인 고개구수 형광 대물렌즈의 경우 이 영역은 측면 치수가 직경 0.3미크론이고 축 길이가 1미크론인 타원체로 정의됩니다.

다광자 현미경 검사에 대한 그림 5(b)에 설명된 광표백(및 세포와 조직에 대한 관련 광손상) 양의 현저한 감소는 공초점 현미경 검사에서 발생하는 것보다 훨씬 적습니다.광표백과 광손상은 살아 있는 세포, 조직 및 기타 생물체 연구에서 형광 현미경 검사의 가장 중요한 두 가지 한계입니다.형광단의 여기는 기저 상태 전자를 여기된 단일항 에너지 상태로 승격시킵니다.여기 상태에서 진동이 완화되는 동안, 단일항 기저 상태로 돌아가는 일반적인 감쇠 대신 삼중항 상태로 계간 교차가 발생할 가능성이 있습니다.삼중항 상태는 반응성이 매우 높고 상대적으로 수명이 길기 때문에 이 조건 시간에서 형광단이 생세포와 반응하거나 분자 변성을 겪거나 비형광 종으로 재배열될 수 있습니다.또한 삼중항 상태의 여기된 형광단은 단일항 산소를 생성할 수 있으며, 이 산소가 인접한 생체 분자의 다양한 기능군과 반응합니다.여기광은 초점으로 가는 도중에 모든 초점면에서 표본을 통과해야 하며, 이 빛의 대부분은 초점 영역을 지나 상당한 거리에 계속해서 전파됩니다.따라서 광시야 및 공초점 현미경 검사의 경우와 같이 빔 경로 전체에서 여기된 형광단의 모집단은 상당한 양의 광표백을 겪고 세포 및 조직 손상을 유발합니다(다광자 기술로 피할 수 있음).

빛에 노출되어 유발되는 세포 손상의 정확한 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않지만, 광손상을 줄이면 형광 현미경 검사로 조사한 생물학적 샘플의 생존력이 극적으로 연장된다는 것이 밝혀졌습니다.장파장 가시광선 및 근적외선에 노출되는 것만으로는 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타나므로 다광자 현미경 검사와 관련된 손상 대부분은 여기에서 발생하고 초점면에 국한됩니다.

다광자 현미경 검사용 검출기

다광자 현미경 검사에서 2차 형광을 통해 방출되는 광자는 대물렌즈 초점면에서 거의 독점적으로 발생하므로 디스캔된 검출에 대한 필요성을 제거하고 보다 유연한 검출 형상을 허용합니다.이러한 다양성 증가로 공초점 현미경 검사에 비해 형광 검출 효율을 상당히 향상시킬 수 있습니다.디스캔된 검출 시스템에서 대물렌즈에 의해 수집된 빛은 핀홀을 통해 검출기로 전달되기 전에 일련의 스캐닝 미러 표면에서 반사됩니다.이미지의 분해능을 높이는 동안 공초점 핀홀은 검출 효율을 크게 감소시키고 표본을 입사 조명에 더 오래 노출시켜야 하므로 광손상과 광표백 가능성이 커집니다.

검출 효율을 최대화하기 위해 디스캔되지 않은 검출기는 일반적으로 대물렌즈 가까이에 위치하며, 샘플 내부 깊은 곳에서 산란 형광 신호를 효과적으로 검출하려면 광 경로의 직경이 더 커야 합니다.다광자 현미경 검사를 위한 일반적인 검출기는 광전자 증배관(PMT)입니다.갈륨비소인(GaAsP) PMT 검출기를 장착하면 표준 멀티 알칼리 PMT보다 높은 양자 효율 덕분에 희미한 형광에서도 높은 신호 대 잡음비 이미지를 얻을 수 있습니다.

그림 6

다광자 현미경 검사의 분해능

다광자 현미경 검사의 분해능은 공초점 현미경 검사의 분해능을 넘지 않으며 사실 더 긴 파장(적외선~근적외선,700~1,200나노미터)을 활용하면 다광자 여기를 위한 더 큰 점 확산 함수가 생깁니다.이는 측면 및 축 분해능 모두에서 약간의 감소로 나타납니다.예를 들어, 700나노미터의 여기 파장과 1.3 개구수 대물렌즈에서 관찰된 측면 분해능은 약 0.2마이크로미터이고 해당 축 분해능은 0.6마이크로미터입니다.스토크스 이동 크기와 결합하면 이러한 값은 동일한 조건에서 기존 공초점 현미경 검사로 관찰되는 분해능보다 최대 30% 더 클 수 있습니다.실제로 공초점 분해능은 유한 핀홀 조리개, 색수차 및 광학 시스템의 불완전한 정렬로 인해 저하될 수 있으며, 이 모든 것이 공초점 현미경 검사와 다광자 현미경 검사 사이의 분해능 차이를 줄이는 역할을 합니다.이 설명에서, 구조가 공초점 현미경으로 적절하게 분해되지 않으면 다광자 여기로 이미지화할 때 더 나아지지 않을 것임(더 나빠질 수도 있음)이 명백해집니다.

디지털 이미지를 수집하거나 3차원 공간 분해능으로 광자를 계수할 때는 초점 부피 내에서 발생하는 형광 방출과 배경에서 발생하는 형광 방출을 구별하는 것이 필수입니다.두 신호 간의 차별화는 기기에 의해(공초점 또는 다광자 기기 사용) 또는 3차원 데이터 집합을 디콘볼루션하여 달성될 수 있습니다.초점면의 형광 방출과 배경 형광을 구별하는 능력은 신호 대 배경(S/B) 비율로 정의됩니다. 여기에서 S는 초점면에서 수집된 광자의 수 또는 강도이고 B는 배경(초점을 벗어난 평면)에서 발생하는 광자를 나타냅니다.공초점 스캐닝 현미경 검사에서 높은 S/B 비율은 공초점 핀홀에 의한 배경 신호 거부로 생성됩니다.그러나 다광자 여기에서는 초점면 외부의 여기가 거의 없기 때문에 S/B 비율이 본질적으로 높습니다.다광자 기술과 공초점 기술 간의 분해능 계산은 공초점 계산을 수행할 때 굉장히 작은 핀홀을 고려하여 비교할 수 있습니다.두 기술 모두에서 신호 대 배경 비율은 전형적인 광시야 형광 현미경 검사보다 일반적으로 몇 배 더 큽니다.

고려해야 할 또 다른 점은 다광자 여기를 통해 낮은 파장의 자외선 영역에서 흡수 전이가 있는 형광단의 활용이 가능하다는 것입니다.공초점 현미경 검사는 약 340나노미터 미만의 형광단을 여기시키는 능력이 제한되기 때문에 검사자들은 파장이 훨씬 더 긴 프로브를 활용하는 경향이 있으며 그에 따라 분해능이 더 낮아집니다.중요한 상황에서 다광자 현미경 검사의 분해능은 공초점 핀홀을 통해 이미징 파장을 제한하여 향상할 수 있고 스캔된 이미지 평면에 배치된 CCD 포토다이오드 어레이 같은 공간적으로 분해된 검출 시스템을 활용해서도 향상할 수 있습니다.

형광단의 여기 특성

다광자 실험에 사용되는 형광단은 단광자 조사를 위한 형광단과 동일한 조사를 받아야 합니다.프로브는 편리한 파장에서 큰 흡수 단면, 높은 양자 수율, 낮은 광표백 속도 및 최대한 낮은 수준의 화학적 및 광화학적 독성이 있어야 합니다.또한 형광단은 심각한 열화 없이 레이저 광원의 고강도 조명을 견딜 수 있어야 합니다.대부분의 경우 검사자는 광시야 및 공초점 형광 현미경 검사에서 마커로 널리 적용되는 동일한 일반 형광단을 이광자 실험에 활용했습니다.

일반 형광단의 여기 스펙트럼은 여기 모드와 입사 광자 파장의 함수 관계에 있습니다.이 의존성 때문에 이광자 흡수 스펙트럼은 상응하는 단광자 스펙트럼과 극적으로 다를 수 있습니다(그리고 다른 경우가 많습니다).실험적으로, 검사된 대부분의 형광단은 단광자 최대 흡수 파장의 두 배에서 이광자 여기를 흡수할 수 있습니다.그럼에도 불구하고, 단광자 단면을 검사하는 것만으로는 복잡한 형광단의 이광자 여기 스펙트럼을 정량적으로 예측할 수 있는 근본적인 근거는 없습니다.여기 상태의 구조에 대한 정보를 얻기 위해 분자 분광법에서 흔히 이용되는 고도로 공액된 비대칭 분자에 대한 단광자 및 이광자 여기 스펙트럼 사이에는 상당한 차이가 있는 경우가 많습니다.그 좋은 예는 방향족 아미노산 유도체인 타이로신과 페닐알라닌인데, 타이로신과 페닐알라닌의 복잡한 이광자 단면은 단광자 여기에서 보이는 것과 상당히 다릅니다.그에 반해, 트립토판에 대한 이광자 스펙트럼(그림 2)은 단광자 여기에서 보이는 프로파일과 매우 유사합니다.

정량적 3차원 재구성 및 디콘볼루션 실험의 경우, 형광단의 이광자 흡수 스펙트럼을 측정하여 여기 파장이 흡수 대역의 피크 근처에 집중되도록 해야 합니다.이광자 단면을 계산할 수 있지만 아무리 잘해도 프로세스는 복잡합니다.흡수 스펙트럼을 직접 실험을 통해 측정하는 것이 선호되는 방법이지만 이러한 실험은 광원의 강도 변동에 비해 흡수된 소량의 입사 출력 때문에 어렵습니다.흡수 단면을 결정하기 위해 열 렌즈 및 음향 광학 기술이 사용되고 있지만 아마도 더 간단한 방법은 알려진 양자 수율로 형광단에서 광자 방출을 검사하는 방법일 것입니다.새로운 이광자 실험을 설계할 때는 의도된 여기 파장의 절반 값 근처에서 흡수 피크를 갖는 형광단 범위를 검사해야 합니다.

그림 7은 여러 일반 형광단에 대해 측정된 이광자 형광 여기 스펙트럼의 특성을 보여줍니다.그림 7의 데이터는 형광 방출 양자 효율과 이광자 흡수 단면의 곱에서 나온 이광자 작용 단면을 나타냅니다.스펙트럼은 모드 고정 티타늄-사파이어 레이저에서 방출된 선형 편광을 활용하여 기록되었습니다.각 스펙트럼에서 검은색 점은 형광단의 단광자 최대 흡수 파장의 두 배를 나타냅니다.표 1은 그림 7의 각 스펙트럼 옆에 표시된 두 글자 이름 코드의 풀이입니다.곡선은 형광단 이광자 여기의 스펙트럼 단면을 나타냅니다.

형광단의 이광자 형광 여기 스펙트럼

표 1

단면 측정은 이광자 흡수에 대한 여기 피크가 단광자 프로파일과 관련하여 매우 유사하거나 청색 이동되는 경향을 나타냅니다(그림 7).더 짧은 평균 파장은 형광단 여기를 모드 고정 레이저의 사용 가능한 파장 범위에 결합하는 데 유리할 수 있습니다.이광자 흡수 스펙트럼의 또 다른 일관된 측면은 일반적으로 해당 단광자 스펙트럼보다 훨씬 더 넓다는 것입니다.이런 점은 여기에 적합한 파장의 범위를 넓혀 실험상의 제약을 완화하고 이광자 단면이 겹치지만 단광자 스펙트럼이 넓게 분리된 2개의 형광단을 동시에 여기시킬 수 있는 능력을 향상시킵니다.삼광자 단면의 측정값은 일반적으로 해당 단광자 스펙트럼과 매우 유사함을 나타냅니다.

흡수 스펙트럼은 단광자 여기와 이광자 여기에서 다른 경우가 많지만 수명, 방출 파장 및 계간 교차 속도 같은 다른 형광 특성은 영향을 받지 않는 것으로 보입니다.이 유사성은 선형 또는 비선형 흡수에 의해 동일한 형광 여기 상태에 도달하고 일단 형광단이 여기되면 여기 모드에 관계없이 동일하게 작동하게 됨을 나타냅니다.또한 이러한 테넌트는 삼광자 여기를 유지하므로 검사자가 대부분의 다광자 실험에서 잘 확립된 비율 측정 및 분광 방법을 활용할 수 있습니다.

다광자 여기의 광손상 및 열손상

모든 형태의 형광 현미경 검사는 생세포의 광손상으로 어려움을 겪고 있으며, 그 정도는 여기 파장, 노출 길이 그리고 세포 프로브로 활용되는 형광단의 화학적 특성에 따라 다릅니다.여기 조명으로 인한 손상은 화학 반응으로 인한 열화와 열손상이라는 두 가지 범주로 구분할 수 있습니다.형광단 여기의 결과로서 생화학 반응에 의해 야기되는 광화학적 부작용은 잘 이해되어 있지 않으며 세포 및 조직 유형에 따라 매우 다양합니다.반면에 열손상은 물에 의한 단광자 흡수와 초점 영역에 있는 형광단의 이광자 흡수로 인해 나타나는 두 가지 메커니즘에서 주로 발생합니다.

연구한 대부분의 세포(특히 포유류 세포)에서는 다광자 형광에 활용되는 고유 형광단에 의한 장파장 근적외선 여기 방사선의 흡수가 거의 없습니다.그러나 세포와 조직을 둘러싼 세포 내 및 세포 간 수분은 상당한 양의 적외선 및 근적외선 조명을 흡수하여 생물학적 표본의 생존력에 손상을 줄 수 있는 과도한 열을 생성할 수 있습니다.반면에 공초점 및 광시야 형광 현미경 검사에 활용되는 더 짧은 가시광선 및 자외선 파장으로 수성 생물학적 환경을 조명하면 상당한 양의 열이 주변 물에 의해 흡수되지 않습니다.

물에 의한 단광자 흡수 때문에 발생하는 열 발생은 초점면 위와 아래의 빔 경로를 따라 발생합니다.제어된 평균 다광자 조건에서 유도된 온도 증가는 각각 700 및 1,000나노미터에서 섭씨 0.065 및 1.1도 범위로 계산되었습니다.이러한 계산은 광학 핀셋 레이저 여기를 사용하여 1,064나노미터에서 수행된 열 측정값과 일치합니다.여기광 빔이 정지해 있는 상황에서는 더 높은 열이 발생할 수 있으며 시간에 따라 대수 관계에서 빠르게 상승합니다.형광단 흡수로 인한 열 발생은 다광자 여기 실험에서 초점 영역으로 매우 국한됩니다.후속 열 방출은 초점 부피를 둘러싼 구체 대칭 영역 내에서 균일하게 발생하며 높은 형광단 농도에서도 많은 양의 열을 생성하지 않습니다.

결론

다광자 형광 현미경 검사는 살아 있는 실험 동물의 세포와 조직에서 동적 이미징을 얻기 위한 선택 방법 중 하나가 되고 있습니다.이 기술은 샘플 깊숙이 위치한 세포의 역학을 관찰할 때 특히 유용합니다.또한 광표백과 광손상 같은 부작용은 다광자 여기에서 최소화되며 초점 부피를 둘러싼 인접 영역에서만 발생합니다.

세포의 광독성은 잘 이해되어 있지 않은 현상이지만 형광 현미경 검사 여러 종류 중 대부분에서 발생합니다.다광자 현미경 검사에 활용되는 더 긴 파장의 더 낮은 양자 에너지 및 더 낮은 매질 고유 흡수는 살아 있는 세포와 조직에 대한 빛의 유해한 영향을 줄이는 역할을 하여 세포 역학 조사에 대한 기회를 제공합니다.다광자 현미경 검사 연구의 주요 장애물은 특히 이광자 및 삼광자 여기에 필요한 필수적인 모드 고정 펄스 레이저 시스템의 비싼 장비 비용입니다.일반적으로 사용되는 가장 인기 있는 초고속 레이저 시스템은 티타늄-사파이어 레이저입니다.티타늄-사파이어 펄스 레이저(700~1,300나노미터)는 파장 가변성 덕분에 용도가 훨씬 더 많습니다.이러한 가용성에 힘입어 이 기술은 생물학 전반에서 광범위하게 적용될 것입니다.