공초점 현미경 스캐닝 시스템

공초점 이미징은 공간적으로 필터링된 개별 시편 지점에서 순차적으로 빛을 모은 다음 전자 신호를 처리하고 궁극적으로 해당 이미지 지점으로 시각적 표시를 행합니다.점별 신호 수집 프로세스에는 관찰 중인 시편 볼륨을 통해 초점을 맞춘 조명 빔을 스캔하는 메커니즘이 필요합니다.공초점 현미경 이미지를 생성하기 위해 일반적으로 세 가지 주요 스캐닝 변형 방법이 사용됩니다.근본적으로 공초점에 해당하는 작동 방식은 스캐닝 디스크라고도 하는 회전식 Nipkow 디스크의 구경을 통해 전송되는 일련의 광점으로 시편을 스캔하는 한편, 고정 스테이지가 있는 스캔 광선 빔(빔 스캐닝)인 고정 조명 광선(스테이지 스캐닝)에 결합된 측면 이동 시편 스테이지를 사용하거나 스테이지와 광원을 모두 고정식으로 유지하여 달성할 수 있습니다(그림 1 및 2 참조).각 기술에는 특정 공초점 응용 분야에는 유리하지만 다른 응용 분야에서는 유용성이 제한되는 성능 기능이 있습니다.

스테이지 스캐닝과 빔 스캐닝 구성은 단일 빔 방법인 반면 회전식 디스크 방식은 다중 빔 스캔 기술입니다.Nipkow 디스크 스캐닝 개념을 사용하는 시스템은 일반적으로 레이저보다는 조명을 위해 비간섭성 광역 스펙트럼 광원(예: 아크 방전 램프)을 사용했으며, 전반적인 밝기 부족으로 인해 형광 응용 분야에서의 사용이 크게 제한되었습니다.그러나 레이저 조명과 결합된 최신 마이크로렌즈 어레이와 정교한 디스크 설계 향상으로 인해 회전식 디스크 공초점 현미경의 잠재적인 응용 분야가 확장되었습니다.Nipkow 디스크 시스템은 탠덤 스캐닝 또는 모노스캐닝 변형 형태로 설계할 수 있습니다.탠덤 스캐닝에서 조명 빔과 검출 빔은 디스크의 정반대 쪽에 위치한 별도의 동일한 구경을 통해 탠덤 경로를 따릅니다.모노스캐닝 시스템은 디스크의 각 회전 구경을 통해 조명과 검출을 동시에 진행하여 대물렌즈를 통과하는 동안 두 개의 광 경로가 나타내는 일치를 유지합니다.

단일 빔 스캐닝의 또 다른 방법은 주로 집적 회로 검사를 위해 특수 반사광 현미경에서 제한적으로 적용되었습니다.대물렌즈 자체는 스캔 렌즈 시스템의 고정 광원을 사용하여 고정 시편을 통해 스캔할 수 있습니다.이 구성은 스테이지 스캐닝과 유사한 광학적 이점이 있지만 고정 시편을 측정 프로브에 맞추거나 다른 방식으로 조작할 수 있습니다.상대적으로 거대한 기존 대물렌즈를 사용할 때 빠른 스캐닝에 적합하지 않으므로 널리 사용되지는 않습니다.

최신 공초점 현미경은 통합 전자 시스템으로, 가장 일반적으로 광시야 표면형광 기기를 기반으로 하며, 여러 개의 레이저 조명원, 전자 및 광학 구성 요소가 포함된 스캔 헤드, 이미지 표시를 위한 컴퓨터와 모니터, 신호 수집, 처리 및 이미지 분석을 제어하기 위한 관련 소프트웨어가 추가됩니다.기본 공초점 광학 구성에서 대물렌즈는 시편 평면에 소스 및 검출기 핀홀 둘 모두의 이미지를 형성합니다.공액 초점면의 현미경 광축에 핀홀을 배치하면 이미지가 시편 초점면 내에서 겹칩니다.초점면 외부의 형광단이 여기되지만, 검출기 핀홀 구경에 의해 초점면 근처에서 발생하는 방출만 제한적으로 검출하여 초점이 맞지 않는 빛을 거부합니다.단일 빔 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 이 포인트 스캐닝 모드에서 샘플링 장치로 작동하며 광학(실제) 이미지를 형성하지 않습니다.이미지를 형성하려면 시편을 통해 샘플링 지점을 이동하고 그렇게 해서 발생한 신호를 수집하고 저장해야 합니다.스캔 헤드는 공초점 이미지를 구성하는 데 필요한 광자 신호 생성을 제어합니다.일반적인 상업용 스캔 헤드의 구성 요소는 그림 1에 나와 있으며, 일반적으로 하나 이상의 레이저 입력, 형광 필터 세트, 래스터 스캐닝 메커니즘, 가변 핀홀 구경, 다중 형광 파장 검출을 위한 검출기(일반적으로 광전자 증배관, 즉 PMT)를 포함합니다.

확장된 시편 이미지 필드를 생성할 수 있도록 공초점 포인트 샘플링 원리를 확대 적용하기 위해 시편의 포인트 초점은 텔레비전 화면(및 기타 비디오 응용 분야, 그림 2(a) 참조)에서 이미지를 생성하기 위해 사용한 것과 유사한 래스터 패턴으로 스캔합니다.이 메커니즘에는 더 느린 수직 스캔, 또는 프레임의 상단에서 하단까지 순차적인 위치로 스캐닝 라인을 오프셋하는 프레임 스캔과 함께 빠른 수평 스캔(라인 스캔)이 필요합니다.공초점 현미경 개발의 역사 동안 포인트 스캐닝을 구현하기 위해 여러 가지 기술이 사용되었으며 일부는 개선을 거쳐 현재의 상용 버전이 되었습니다.단일 빔 레이저 스캐닝 기기에서 일반적인 래스터 스캐닝 메커니즘은 상호 수직 축을 중심으로 회전하는 검류계 모터로 구동되는 2개의 고속 진동 미러를 사용합니다.하나는 x축을 따라 스캔하고 다른 하나는 y축을 따라 스캔하는 두 개의 미러를 조정하여 직선 래스터 스캔을 생성합니다.미러의 스캐닝 속도는 빛의 속도에 비해 미미하므로, 결과적으로 방출된 형광은 대물렌즈에 의해 수집되어 원래 조명 경로를 따라 검출기 핀홀의 공액 초점면으로 되돌아가거나 디스캔될 수 있습니다.검출기 구경을 비추는 신호 강도의 변화는 여기 빔이 스캔될 때 시편의 여러 지점에서 방출되는 변화에 상응합니다.

최적의 이미징 성능을 제공하는 데 필요한 이상적인 공초점 스캐닝 시스템의 몇 가지 특성은 실제로 실현하기가 매우 어렵습니다.거의 모든 스캐닝 시스템 구성은 몇 가지 작동상의 단점이 있으며, 결점을 고치기 위해 다양한 광학 및 전자 설계상의 수정이 이루어졌습니다.포인트 스캐닝을 구현하는 여러 방법은 감도를 낮추거나 유연성 또는 이미지 품질에 심각한 손상을 수반하며, 현재 시판되어 생산되는 시스템에서는 사용되지 않습니다.스캐닝 시스템 설계의 가장 중요한 요구 사항 중 하나는 스캔 극단에서 조도 저하를 방지하기 위해 대물렌즈 동공(후면 초점 구경)을 전체 스캔 주기 동안 빛으로 완전히 채우는 것입니다.이를 위해 대물렌즈 후면 구경과 공액 관계인 고정 지점에서 빔을 회전시키는 스캔 설계로 구경에서 빔의 움직임을 최소화하는 것이 가장 좋습니다.스캐닝 중에 빔이 흔들릴 때 고정 피벗 포인트를 유지하는 것은 기술적으로 어려운 일이며, 일부 시스템은 빔 확장을 증가시켜 구경을 과도하게 채워 소량의 빔 이동을 보상합니다.이는 빛을 낭비하고 시스템의 광자 효율을 감소시키는 단점이 있습니다.

공초점 스캐닝 메커니즘의 또 다른 바람직한 특성은 이미징 응용 분야에 맞추어 다양한 스캐닝 모드를 조정할 수 있는 유연성을 제공하기 위해 최대한 높은 프레임 속도로 스캔하는 것입니다.이 경우 빔 스캐닝을 생성하는 움직이는 구성 요소의 관성은 최소여야 하고 빔이 시편을 스캔하지 않는 시스템 데드 타임(즉, 각 스캔 주기 사이의 간격)을 최소화해야 합니다.시편을 실제로 스캔하는 데 사용되는 각 전체 프레임 스캔 간격의 비율을 시스템의 듀티 사이클이라고 합니다.빔의 비생산적인 스캔을 최소화하는 것은 높은 프레임 속도를 달성하는 데 필수적일 뿐 아니라 일부 기기 설계에서 열악한 듀티 사이클 사양으로 인한 불필요한 시편 광자 손상을 줄여줍니다.

광축을 중심으로 스캔 래스터를 자유롭게 회전시키는 기능은 시편 모양이나 기타 특성과 관련하여 스캔 방향을 최적화하는 수단인 컨포컬 이미징에 매우 중요한 기능입니다.섬유 다발과 같은 길쭉한 형상을 이미징할 때 형상의 장축과 평행한 빠른 스캔 방향의 방향 지정은 시편 신호의 시간 분해능을 크게 향상시킵니다.또한 래스터를 회전하는 기능을 통해 이미지 필드를 가장 효율적으로 활용하는 방식으로 시편 형상의 방향을 지정할 수 있습니다.래스터 방향의 회전을 허용하지 않는 스캐닝 배열은 시편 자체가 쉽게 회전될 수 없는 한 시스템의 실용성을 심각하게 제한할 수 있으며, 통상적으로 실현 불가능한 훨씬 더 곤란한 작업입니다.

시편에서 조명 스폿의 선형 운동을 생성하는 데 필요한 광학 배열은 대물렌즈가 텔레센트릭으로 보정된다는 사실을 포함하여 현미경의 기하학적 광학을 고려하여 도출합니다(텔레센트릭 렌즈 시스템은 입사동과 출사동을 무한원에 배치함).대물렌즈의 전체 광학 보정을 실현하려면 이미지와 시편 평면이 대물렌즈로부터 고정된 거리에 있어야 하며, 따라서 공액 이미지 평면과 공액 텔레센트릭 평면의 위치를 알 수 있습니다.중요한 광학 특성은 모든 광선이 시편 평면에서 소스 지점의 위치 함수인 각도로 텔레센트릭 평면과 교차한다는 것입니다.평면 미러는 광선의 전파 각도를 변경할 수 있으므로, 광축의 공액 텔레센트릭 평면에 미러를 배치하면 광선 각도의 변화가 시편에서 초점의 선형 운동을 생성하는 메커니즘이 제공됩니다.따라서 가장 간단한 경우에 대물렌즈 공액 텔레센트릭 평면의 중심에 피벗 포인트가 있는 미러를 배치하면 미러의 피벗 각도의 함수인 시편 평면에서 조명 스폿의 위치를 변경할 수 있는 1차원 빔 스캐너가 생성됩니다.모든 공액 텔레센트릭 평면은 대물렌즈 텔레센트릭 평면의 이미지입니다.중간 광학 시스템을 사용하면 텔레센트릭 특성을 유지하면서 대물렌즈의 입사 구경에 미러 이미지를 형성합니다.

실제 상황을 고려했을 때는 특정한 전체 시스템 설계에 대해 취하는 접근 방식의 유형이 일반적으로 정해져 있지만, 원칙적으로 이 스캐닝 개념은 미러를 두 방향으로 동시에 스캐닝하거나 두 번째 미러를 추가하여 두 개의 수직 축으로 확장할 수 있습니다.빔을 수직 방향으로 스캔하기 위해 2개의 미러를 사용하는 경우 공액 텔레센트릭 평면에 배치하거나 서로 근접한 위치에 배치해야 합니다(근접 결합).이러한 스캐닝 시스템은 빔을 직교 방향으로 편향시켜서 완전한 2차원 이미지를 형성하는 데 필요한 x축 및 y축을 따라 빠른 스캔 동작과 느린 스캔 동작을 생성할 수 있습니다.

스캐닝 시스템 구성 요소는 다양하게 배치할 수 있지만, 기본 요구 사항을 충족해야 합니다.광학 시스템의 회절 제한 성능을 보장하기 위해 대물렌즈의 후면 초점면(입사 구경)은 스캐닝 중에 평면파에 의해 지속적으로 균일하게 채워져야 합니다.이 구경의 물리적 직경은 대물렌즈의 특성에 따라 달라지기 때문에 조명 핀홀을 포함한 다른 모든 구성 요소는 사용 중인 대물렌즈에 맞추어야 합니다.공액 텔레센트릭 평면은 보조 광학 장치를 추가하여 필요한 위치에 생성할 수 있으며, 이 접근 방식을 취하는 경우 시스템과 함께 사용하려고 선택한 대물렌즈와의 호환성과 관련하여 공액 텔레센트릭 평면의 특성도 신중하게 고려해야 합니다.조명 레이저의 빔 특성, 특히 가우시안 빔 프로파일의 직경은 대물렌즈 입사 구경의 조명과 관련된 핀홀 직경과 기타 변수의 조정에서 중요한 요소입니다.

가장 간단한 빔 스캐닝 공초점 구성에서 스캔 미러는 대물렌즈의 후면 초점면과 공액 관계인 스캔 렌즈의 후면 초점면에 위치합니다.그림 3(a)는 무한 보정 대물렌즈에 필요한 튜브 렌즈가 포함된 단일 미러 배열을 보여줍니다.이 구성을 사용하면 한 축에서 쉽게 스캔할 수 있습니다.이론적으로 x-y 스캐닝을 실현하는 최적의 방법은 두 축에서 단일 미러를 동시에 스캔하는 것입니다(카다닉 스캐닝이라고 함).두 개의 스캐닝 미러가 더 흔하게 사용되며, 두 가지 가능한 구성이 그림 3(b)와 3(c)에 설명되어 있습니다.미러가 밀접하게 결합된 경우(그림 3(b)), 시스템은 추가적인 간섭 광학 장치 없이도 만족스럽게 작동할 수 있습니다.스캐닝 미러 사이의 거리가 멀어지면(그림 3(c)), 다중 렌즈 텔레센트릭 릴레이 시스템을 활용하여 광학 성능을 최적화해야 합니다.

x-y 래스터 스캔을 달성하는 메커니즘은 공초점 스캐닝 시스템의 가장 중요한 측면으로 간주되지만, 3차원 이미징을 위한 일련의 광학 섹션을 획득하고 x-z 또는 y-z 2차원 이미지를 수집하는 것은 물론 모든 형태의 자유선 z축 스캐닝을 하기 위해서는 일부 z축 스캐닝 방법이 필요합니다.일반적인 현미경 구성은 대물렌즈 또는 현미경 스테이지를 변환하여 대물렌즈-시편 거리를 변경합니다.이동은 제한된 거리 범위에서 이루어지지만 압전 구동기 또는 검류계 장치를 사용하여 정밀하게 진행할 수 있습니다.그러나 더 일반적으로 마이크로스테퍼 모터는 현미경의 미세 초점 제어를 구동하는 데 사용되며, 최신 기기에서 스테퍼는 10나노미터 정도의 최소 단계 크기에서 초점 위치를 지정할 수 있습니다.생물학적 형광 응용 분야의 경우 이 정밀도에 대한 z 위치 지정이면 충분하고도 남습니다.

단일 빔 기기의 기술이 발전하면서 생세포의 동적 프로세스를 따르기 위해 비디오 속도로 이미징을 제공할 수 있는 고속 스캐닝 기기가 개발되었습니다.회전식 폴리곤 미러 스캐너는 매우 높은 스캔 속도를 달성할 수 있고 많은 광학 장치에 사용되지만 고분해능 현미경에 도입되는 데 필요한 조명 및 검출 정밀도를 제공하지 않습니다.스캐닝 미러와 음향 광학 편향기(AOD)를 결합하는 다양한 구성도 탐구되었습니다.일부 배열에서 AOD는 한 축에서 매우 빠른 스캐닝을 제공하며, 미러 스캐너는 느린 축을 제어합니다.이 접근 방식은 일부 응용 분야에서 허용되지만, 장파장 형광 방출이 파장에 특정한 음향 광학 변조기를 통해 다시 디스캔되는 것을 허용하지 않기 때문에 공초점 형광 이미징에서 문제가 됩니다.여전히 한 축에서 진동하는 부분적으로 디스캔된 신호는 슬릿 구경을 통해 광전자 증배관으로 전달되거나 선형 어레이 CCD 검출기에서 이미지화될 수 있습니다.그렇게 해서 나온 이미지는 한 축에서만 공초점이지만 해당 특성은 일부 응용 분야에서 허용됩니다.단일 빔 시스템에서 높은 프레임 속도를 달성하기 위한 보다 일반적인 접근 방식은 빠르게 진동하는 공진 미러 스캐너를 활용하는 것입니다.대부분의 주요 제조사는 전체 관측 시야에서 초당 30프레임의 속도로 비디오 속도 이미지를 가능하게 하는 표준 스캔 선택 사양으로 공진형 스캐너를 통합했습니다.공진형 스캐너는 Y에서 클리핑하여 모세혈관 혈류 또는 칼슘 동역학과 같은 높은 시간 분해능이 필요한 응용 분야를 위해 초당 수백 프레임의 속도를 지원할 수 있습니다.

다중 빔 스캐닝 기술은 단일 빔 스캐닝 구성에 대한 대안을 제공하지만 이전에는 낮은 조명 효율로 인해 고분해능 형광 응용 분야에서 사용이 제한되었습니다.탠덤 또는 모노스캐닝 변형에서 회전식 디스크 스캐너는 현미경 중간 이미지 평면에 조명 및 검출 핀홀로 기능하는 수백 개의 구멍을 배치합니다.일반적인 Nipkow 디스크 스캐닝 시스템의 구성은 그림 2(b)에 나와 있습니다.디스크의 구멍은 디스크가 회전할 때 많은 수의 빔이 이미지 필드를 균일하게 스캔하도록 배열되어 단일 빔 스캐너보다 훨씬 빠른 속도로 시편을 완전히 커버합니다.디스크 스캐닝 현미경이 실제 이미지를 형성하기 때문에 CCD 또는 CMOS 카메라는 이미지 평면에 직접 위치하여 광전자 증배관에서 나타내는 것보다 훨씬 더 큰 양자 효율로 방출된 신호를 수집할 수 있습니다.동적 프로세스의 실시간 초점 조절과 이미징을 허용하는 이러한 이점에도 불구하고 몇 가지 단점으로 인해 디스크 스캐닝 공초점 시스템은 실제로는 제한적으로 활용됩니다.이전에는 가장 심각한 단점 중 하나가 기존의 광역 스펙트럼 광원에 대한 일반적인 의존성과 디스크에서 발생하는 극심한 광 손실이었습니다.그러나 디스크 시스템 설계가 발전하고 레이저 소스가 적용되면서 일부 효율성 문제를 극복할 수 있었습니다.각 디스크에는 크기가 고정된 구멍이 있기 때문에 핀홀 직경은 사용 중인 특정 대물렌즈와 일치할 수 없으며, 결과적으로 해당 디스크와 최적으로 수행되는 대물렌즈의 선택지가 제한됩니다.또한 소스 및 검출기 핀홀의 직경을 독립적으로 최적화할 수 없습니다.

초기 Nipkow 디스크 시스템의 특징인 밝기 부족을 개선하기 위한 한 가지 기술은 마이크로렌즈를 활용하여 광원을 강화하는 것입니다.이전 시스템은 디스크에 입사되는 조명의 약 1%만 전송했으며 낮은 신호 수준을 보상하기 위해 냉각 CCD 또는 CMOS 카메라를 사용해야 했습니다.최신 디스크 스캐닝 현미경 설계에서는 Nipkow 디스크와 일직선으로 돌아가고 Nipkow 디스크 구경을 통해 양방향으로 통과하는 빛을 증폭하는 수천 개의 마이크로렌즈가 포함된 두 번째 디스크가 통합됩니다.마이크로렌즈, 레이저, 카메라 기술의 발전으로 디스크 스캐닝 현미경은 라이브 셀 이미징 응용 분야에 없어서는 안 될 도구가 되었습니다.

결론

공초점 기기의 실제 성능의 일부 측면을 개선하기 위한 노력으로 다양한 추가 스캐너 수정 방안이 제안되거나 구현되었습니다.공초점 형광 현미경의 모든 측면은 근본적으로 효율성과 연속 데이터 수집의 고유한 한계와 근본적으로 관련이 있습니다.유용한 신호를 획득할 수 있는 효율성은 이미지 대비와 시편 광손상 사이에 도달해야 하는 균형을 정의하고, 샘플링 스캔의 공간 분해능, 신호 대 잡음비, 이미지 획득 속도 사이의 직렬 데이터 수집에서 필요한 절충안을 통제합니다.

고분해능 형광 이미징의 경우 현재 사용 가능한 가장 정교한 다목적 스캐닝 기술은 검류계 스캐너를 활용하는 변형 기술이며, 대부분의 주요 현미경 제조사는 이 방법을 사용하는 공초점 기기를 하나 이상 생산합니다.광자 효율의 중요성 때문에 상대적으로 단순한 단일 빔 스캐닝 기술은 대부분의 형광 응용 분야에서 디스크 스캐너를 확실히 능가합니다.그러한 기술은 다양한 기존 현미경 광학 시스템 및 비디오 장비와 호환되며 일반 현미경 원리를 잘 준수하고 핀홀을 유연하게 조정할 수 있어 특정 광학 및 시편 변수에 대해 최적화할 수 있습니다.