공초점 현미경 대물렌즈

대물렌즈는 일반적인 광학 현미경 구성에서 이미지의 정보 함량을 결정하는 데 가장 중요한 시스템 부품입니다.훌륭한 표본 세부 정보의 대비 및 분해능, 정보를 얻을 수 있는 표본 내 깊이, 이미지 필드의 측면 범위는 모두 대물렌즈의 설계와 관찰에 사용되는 특정 조건에서의 대물렌즈 성능이 결정합니다.스캐닝 공초점 기술의 대물렌즈에 추가 요구 사항이 부과되며, 이 중요한 이미징 요소는 조명 콘덴서 역할을 하며 용납할 수 없는 이미지 저하 노이즈를 도입하지 않고 광범위한 파장과 저조도에서 정밀하게 수행해야 하는 경우가 많습니다.

시스템 장치 기능과는 상관없이 대물렌즈로 처음 포착하지 않은 이미지에는 정보를 전혀 추가할 수 없습니다.이미징 경로에 놓인 특정한 중간 구성 요소는 보정 기능을 수행할 수 있지만, 이같은 구성 요소의 주요 성능에 대한 요구 사항은 대물렌즈에서 받는 기본 이미지 정보를 최대한 저하시키지 않는 것입니다.전통적으로, 특정 응용 분야에 관한 대물렌즈를 선택할 때 고려되는 주요 변수는 배율, 건식 혹은 이멀젼 설계의 필요 여부 및 렌즈 시스템의 개구수입니다.현미경 제조업체의 지속적인 광학 개선뿐 아니라 레이저, 형광 염료, 새로운 표본 라벨링의 기술적인 개선으로 비롯된 새로운 이미징 기술의 발전은 특정 연구 영역에서 극적으로 향상된 진보를 이뤘습니다.특히 세포 및 분자 생물학, 신경과학 분야가 특히 그러하며, 형광 기술과 결합된 공초점 현미경 검사는 연구 도구로 널리 사용되고 있습니다.

그림1에서는 자외선에서 근적외선까지 레이저 조명을 사용하기 위해 특별히 설계된 고성능 대물렌즈를 볼 수 있습니다.해당 대물렌즈는 60배 평시야(Plan) 아포크로매트 오일 이멀젼 모델로, 405~1,000nm 범위의 파장을 위해 보정되었습니다.이 대물렌즈가 유용한 응용 분야로는 동시 형광 및 차등 간섭 대비(DIC) 관측이 있습니다.

공초점 기기의 대물렌즈에 일반적으로 요구되는 사항은 다른 주요 현미경 응용 분야에서와 유사하지만, 신기술에 더해지기만 하는 요구 사항 덕분에 그 어느 때보다 흔히 이러한 렌즈 시스템이 갖는 성능의 한계에 가까이 가게 되었습니다.특정 응용 분야가 갖는 특정한 한계는 다른 대물렌즈의 특성이 중요하거나, 기존에 중요하다고 여겨지는 특성들보다 더 중요할 수 있다는 점을 분명히 했습니다.현재 유망 기술의 필수 요구 사항을 충족하기 위하여 제조업체들은 이러한 방법에 대하여 성능을 최적화하는 것을 목표로 하는 새로운 광학을 도입하였습니다.높은 개구수와 고도로 보정된 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈의 개발은 수성 매체에서 수행되어야 하는 살아있는 세포와 조직 연구의 급격한 증가에 대응한 예시입니다.공초점 현미경에서 특정하게 요구되는 사항은 공초점 성능에 더 중요한 다른 설계적 목표를 달성하기 위해 하나 이상의 분해능을 절충하는 수차를 덜 엄격하게 보정하는 광학 개발로 이어질 가능성이 있습니다.

레이저 스캐닝 현미경 분해능

광학 시스템에서 분해능은 일반적으로 최종 이미지에서 분리된 것으로 구별할 수 있는 두 표본 특성 사이의 최소 분리 거리로 받아들여집니다.시각적으로 인식하기 위해 필요한 구체적인 대비를 기반으로 정의되는 분해능은 광 파장(λ)과 광학 시스템의 개구수(NA)의 함수로 정량화할 수 있습니다.렌즈 구경을 통해 회절된 파면 사이의 간섭은 이미지 평면에서 에어리디스크의 강도 분포 즉, 다음 방정식에 의해 이상적인 회절 제한 시스템에서 얻는 직경(d)입니다.

d_에어리= 1.22 • λ/NA

잘 알려진 레일리 기준에 따르면 두 개의 동일한 점이 에어리디스크 직경의 절반만큼 떨어져 있으면 거의 식별할 수 없는 것으로 생각됩니다.결과적으로, 에어리 반지름(r)은 횡방향 분해능과 같으며, 앞에 언급한 방정식을 수정하여 정의됩니다.표면형광이 활용될 때, 대물렌즈는 콘덴서와 대물렌즈 기능을 모두 수행하며 다음 식에서 NA는 대물렌즈 개구수를 나타냅니다.

r_에어리= 1.22 • λ/(2 • NA)

점 객체에서 에어리 패턴으로 강도의 횡 측 재분포로 이어지는 회절 제한 또한 광축을 따라 디포커싱을 생산하며, 이미지 포인트의 크기와 모양을 변화시킵니다.3차원 강도 점 확산 함수는 강도 분포를 설명하고 표본 정보를 이미지 평면으로 전송할 때 광학 시스템의 성능을 나타냅니다.광학 수차 범위는 굴절 렌즈 시스템의 특징이며, 대물렌즈 설계에 의해 보정되지 않거나 다른 광학 구성 요소로 보완되지 않는 장치는 이미지의 각 표본 점을 나타내는 강도 분포를 변경하며, 이상적인 회절 제한 성능 측면에서 이미지 품질을 저하시킵니다.특정 기술을 위한 대물렌즈를 선택할 때는 공초점 응용 분야의 잠재적 색수차가 갖는 상대적 중요성을 고려해야 합니다.대물렌즈의 설계와 성능의 주요 요소는 특히 공초점 현미경과 연관이 있으므로 다음 섹션에서 논의할 것입니다.

생물학 응용 분야에서 가장 널리 사용되는 공초점 현미경 장치는 컴퓨터 제어 스캐닝 시스템을 사용하여 대물렌즈를 통해 초점이 맞춰진 고정 표본 전체에 걸쳐 조명 레이저 빔을 편향시킵니다.스캔된 빔이 광축의 각 면으로 편향되 대물렌즈 요소의 주변 영역을 활용하므로 이를 오프 축 공초점 스캐닝이라 부릅니다.초기에 시행한 일부 광학 현미경 스캐닝 기술은 레이저 빔이 광축에 고정되어 표본 스테이지나 대물렌즈가 스캔된 온 축 스캐닝을 활용했습니다.

원칙적으로 이 두 가지 스캐닝 방식은 유사한 결과를 생성할 수 있으나, 최적의 성능을 달성하기 위한 대물렌즈 선택에 연관된 요구 사항은 온 축 및 오프 축 조명 스캐닝에 따라 다르며, 대물렌즈를 통해 방출된 형광을 수집하는 것에 대한 고려 사항 또한 다릅니다.세 번째 스캐너 유형은 회전식 Nipkow 디스크를 사용하여 광원이나 현미경 스테이지를 움직이지 않고 표본 위 수많은 조명 점을 스캔합니다.그러나 Nipkow 시스템은 고강도 스캔 레이저원을 사용하는 구성에 비해 세포 손상을 최소화하는 기능 때문에 생세포 검사에서 선호됩니다.

대물렌즈 성능에 영향을 주는 렌즈 수차는 두 가지 범주로 나뉠 수 있으며, 여기에는 파장에 영향을 받지 않는 비색수차와 파장에 영향을 받는 색수차가 포함됩니다.색수차는 횡방향 색수차 혹은 종방향 색수차로 특징지어지며. 파장의 영향을 받지 않는 그룹에는 구면수차, 코마, 비점 수차, 필드 곡률, 및 왜곡이 포함됩니다.색수차와 구면수차는 전체 이미지 필드에 영향을 주며, 나머지 수차는 오프 축 구역에서 더욱 일반적입니다.색수차와 구면수차(그림2 참조)는 공초점 성능에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 높습니다.일반적으로 색수차는 절차를 통해 변경될 수 없으며, 광학 장치 설계로 처리해야 합니다.기타 아티팩트, 특히 구면수차는 일반적으로 대물렌즈의 부적절한 사용 혹은 불일치된 광학 구성 요소 도입으로 악화되지만, 적절한 기술을 따라 하거나 광학 시스템의 조정을 통해 최소화하거나 보완할 수 있습니다.

구면수차

구면수차는 공초점 성능에 가장 중요한 비색수차이며, 근축과 주변 광선이 연속적인 평면에 집중되게 하는 구면 렌즈 장치의 특성을 나타냅니다.다른 렌즈 영역을 통과하는 광선 경로의 다양한 굴절 정도는 점광원의 초점 이미지를 흐리게 하며, 초점 평면 위와 아래에 비대칭적인 강도 변화를 일으킵니다.모든 현대 대물렌즈에서 대물렌즈 설계를 위해 지정된 작동 변수가 정확히 충족되는 경우, 구면수차는 시각적으로 감지될 수 없는 수준으로 보정됩니다.안타깝게도 실제로는 대물렌즈의 광학 설계 기준으로부터 벗어나 구면수차 유도로 이어질 가능성이 일부 존재합니다.구면수차는 대물렌즈와 표본, 이미지 평면 사이의 정확하게 지정된 거리 관계에 대해서만 적절하게 보정될 수 있으므로, 대물렌즈에 대해 지정된 튜브 길이가 유지되지 않는 경우 아티팩트가 뜻하지 않게 도입될 수 있습니다.이는 유한 보정 시스템에서 필요한 튜브 길이 외에 다른 튜브 길이를 지닌 현미경에, 또는 이러한 시스템의 수렴되는 빔 경로에 필터 등 광학 부품이 도입되어 대물렌즈가 사용되는 경우 발생 가능합니다.

구면수차에 대한 최적의 보정을 위해서는 대물렌즈 외부의 이미징 매체에 주의해야 하며 이는 성능 저하의 또 다른 잠재적 원인이 됩니다.대물렌즈 특성은 설계에 의해 고정되며, 보정환에 의한 조정을 제외하고 다양한 작동 조건을 수용할 것이라 기대할 수 없습니다.구면수차를 크게 증가시킬 수 있는 요소에는 대물렌즈와 표본 사이의 저품질의 이멀젼 오일, 비표준적인 커버 글라스 두께, 표본 봉입제, 표본 자체가 있습니다.대물렌즈의 전면 렌즈 표면과 표본 사이에 들어가는 물질은 무엇이든 이미징 시스템의 중요한 구성 요소가 됩니다.대물렌즈의 설계 요구 사항을 준수하는 것은 더 높은 개구수에 훨씬 더 결정적입니다.커버 글라스 두께나 굴절률의 변화는 특히 ‘건조(논이멀젼)' 대물렌즈에서 구면수차를 증가시킬 수 있습니다.높은 개구수의 건조 대물렌즈는 일반적으로 두께 0.17mm의 커버 글라스에서 최적의 성능을 달성하도록 설계되며, 표본이 글라스 바로 아래에 장착되어 글라스와 접촉됩니다.

비표준적인 커버 글라스의 두께를 사용할 때 구면수차 보정을 가능하게 하기 위해 다양한 두께에 맞게 설정할 수 있는 조정 가능한 보정환이 많은 대물렌즈에 장착되어 있습니다.대물렌즈의 초점 길이를 변경하기 위하여 내부 렌즈 그룹을 변환하면 보정환이 작동합니다.정확한 두께의 커버 글라스를 사용하더라도 글라스와 표본 사이의 봉입제 층이 존재하면 이상적인 광학 상황에서 멀어지며 구면수차 정도를 증가시킵니다.더불어, 보정환은 이러한 특성을 지닌 굴절률의 변화로 유도되는 구면수차를 최소화하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 공초점 현미경에서 핀홀에서의 강도 감소 및 축 초점 이동으로 인한 깊이 판별 감소로 이어집니다.

이멀젼 오일 사용을 염두에 둔 대물렌즈는 일반적으로 특정 파장에서 굴절률 1.518, 두께 0.17mm의 커버 글라스 및 정확히 정의된 굴절률을 지닌 이멀젼 오일의 사용에 최적화되었습니다.커버 글라스와 이멀젼 매체와 관련된 작동 조건을 명시함으로써 구면수차는 대물렌즈 유형에 좌우되는 여러 파장 값을 위한 대물렌즈 설계로 보정될 수 있습니다.표본과 봉입제에서 대물렌즈 전면 요소까지 광 경로 전체에 걸쳐 각 재료 사이 굴절률이 일치시키는 것의 중요성은 특히 생물학 표본으로 높은 분해능을 달성하려는 시도에서 역사적으로 가장 문제가 되는 이미징 기준입니다.하위 세포 성분의 굴절률은 기존 이멀젼 매체의 굴절률보다 현저히 낮으며, 많은 경우 이러한 굴절률은 불확실하며 표본 전체에 걸쳐 다양합니다.고정된 재료에서도 봉입제 굴절률은 사용 가능한 이멀젼 오일의 굴절률과 일반적으로 동일하지 않습니다.

생리식염수 용액에서 배양, 유지되는 살아있는 세포의 역동적인 과정을 조사하는 중에, 오일과 물 굴절률 간의 불일치는 오일 이멀젼 대물렌즈의 성능을 결정적으로 제한합니다.일차적 문제는 물의 굴절률(1.33)과 이멀젼 오일의 굴절률(약 1.5)의 불일치로, 가장 높은 개구수를 갖는 오일 이멀젼 대물렌즈의 최대 잠재력에 도달할 수 없다는 것입니다.공초점 현미경 검사의 응용 분야에 있어 중요 요소는 개선된 형광 이미징과 두꺼운 표본의 3차원 표현이며, 오일 이멀젼 대물렌즈가 수성 표본과 함께 사용될 때 도입되는 구면수차는 허용 가능한 이미지를 얻을 수 있는 매체의 깊이를 제한합니다.일반적으로, 높은 개구수의 오일 이멀젼 대물렌즈는 커버 글라스 밑 15~20㎛ 이하의 이미지 평면에서 사용되도록 설계됩니다.그러나 수성 표본에 적용될 경우, 워터커버 글라스에서 유도된 구면수차는 10㎛만큼 낮은 깊이에서 상당한 수준에 도달할 수 있습니다.일례로, 그림3에 설명된 점 확산 함수는 0~8㎛ 범위의 침투 깊이에서 플랜 아포크로매트 오일 이멀젼 대물렌즈에서 발생하는 구면수차의 증가 정도를 보여줍니다.

수성 생물학 표본에서 3차원 데이터를 수집하기 위해 공초점 형광 기술을 사용하는 것에 대한 관심은 현미경 제조업체가 높은 개구수 및 고도로 보정된 워터 이멀젼 대물렌즈를 다수 도입하게 된 주된 동기였습니다.그러나 물은 두 가지 단점을 가집니다. 물은 쉽게 마르므로 장기적인 타임랩스 이미징에는 실용적이지 않으며 굴절률이 1.33으로 낮기 때문에 높은 개구수 대물렌즈를 설계할 경우 사용될 수 없다는 것입니다.그렇기 때문에, 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈의 굴절률 1.4가 살아있는 세포의 굴절률과 비슷하고 마르지 않기 때문에 제조업체들은 이 목적을 위해 대물렌즈를 도입했습니다.구면수차는 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용한 살아있는 세포의 공초점 연구에서 주된 광학적 한계이며 수성 매체와 변화하는 세포 이하의 요소에 관한 관찰 깊이에 비례해 증가합니다(그림3 참조).이미징에 미치는 부정적 영향에는 검출기 핀홀에 도달하는 방출 형광 강도의 비율 감소로 인한 대비 및 신호 강도의 손실, 미세 표본 특징에 대한 분해능 손실, 3차원 이미지 재구성의 무결성에 영향을 미치는 z축 위치 정확도 감소가 포함됩니다.실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용함으로써 커버 글라스 아래의 상당한 깊이에서 수성 매체에 표본을 이미징할 때 구면수차 열화를 방지 혹은 최소화할 수 있어 공초점 기술이 가진 이점을 충분히 실현할 수 있습니다.긴 작동 거리를 갖는 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈는 수성 매체의 깊이 200mm 이상에서 정확한 3차원 데이터를 수집할 수 있습니다.

오일 이멀젼 대물렌즈는 광학 보정 정도와는 상관없이 물에 이멀젼된 표본을 이미징하기 위한 최선의 선택지는 아닙니다.최적의 이미지 품질은 커버 글라스와 직접 닿은 표본 영역에서만 얻을 수 있습니다.더 깊은 곳에서 구면수차가 갖는 효과가 대비와 분해능을 저하하고 공초점 신호 대 잡음 비율이 급격하게 감소하는 정도로 이미지 밝기를 떨어뜨립니다.먼 거리에서 이미징할 시 수성 매체에서 구면수차를 최소화하기 위한 최적의 솔루션은 고도로 보정된 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하는 것입니다.

구면수차 보정에 사용되는 한 가지 방법은 물과 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈에 보정환을 도입하는 것입니다.이러한 보정환은 커버 글라스 두께의 변동에 의해 유도되는 구면수차 등에 대해 가변성 보정을 제공합니다.더불어, 이러한 유형의 보정환은 생리학적 매체와 세포 및 조직 구성 요소의 굴절률 차이와 온도나 용질 농도 변화에 따른 굴절률 변화를 보완하는 데 유용합니다.유도된 구면수차에 영향을 줄 수 있는 다양한 요소가 존재하므로 최적의 두께를 가진 커버 글라스를 사용하는 경우에도 조절 가능한 보정이 공초점 응용 분야에서 대물렌즈가 갖는 바람직한 특징이 됩니다.

오프 축 광학수차

코마라 불리는 일반적인 광학 수차는 주로 광학 축에서 멀리 떨어진 점과 같은 광원에 영향을 주며, 이미지 포인트의 줄무늬 같은 방사 왜곡을 생성해 필드 각도에 따라 심각도가 증가합니다(그림4 참조).코마는 동일한 요소에 의해 잠재적으로 유도된다는 점에서 구면수차와 다소 유사합니다.이 수차는 현대 광학 시스템에서 일반적으로 적절한 렌즈 부품을 사용하여 잘 보정되며 코마와 구면수차가 제거된 대물렌즈는 무수차 렌즈로 분류됩니다.코마는 주로 오프 축 수차이므로, 일반적으로 오프 축 빔 경로를 이용하는 공초점 레이저 스캐닝 시스템에 중요하며, 표본 스캐닝(온 축) 공초점 현미경 검사 요소는 아닙니다.

여러 추가 유형의 기하학 수차는 공초점 대물렌즈 성능에 잠재적으로 중요하며, 중심에서 먼 이미지 필드의 영역에서 모든 것이 더욱 분명하기 때문에 레이저 스캔 공초점 시스템의 성능에 영향을 끼칠 가능성이 더 높습니다.공초점 이미징의 광학적 요구 사항은 고도로 보정된 광학 장치만이 적절히 수행할 수 있으며, 중요한 기하학 수차는 일반적으로 이러한 범주에 속하는 대물렌즈에서 최소화될 것입니다.그러나 대물렌즈 선택 시, 특히 특정 응용 분야에서 더 중요할 수 있는 또 다른 변수를 최적화하기 위해 특정 성능 특성이 희생되는 경우, 이러한 수차와 잠재적인 문제가 생길 수 있음을 인식하는 것이 유익합니다.

보정되지 않은 비점수차는 광학 축으로부터 더 먼 거리에서 효과를 증가시키면서 이미지 강도, 선명도, 대비를 감소시킬 수 있습니다(그림4).비점수차 이미지 포인트의 기하학적 구조는 이미지 파면을 통과하는 단면인 두 직교 평면을 고려하여 정의될 수 있습니다.비점수차 시스템의 접평면과 정중면은 서로 다른 초점 거리를 가지며 완벽히 대칭인 표본 점에 별도의 반지름을 나타낼 수 있습니다.이러한 수차는 초점에 따라 이미지 평면에서 방사형이나 접선형으로 길어지는 오프 축에 위치한 대칭 점과 같은 형상으로 이어집니다.두 극단 사이 절충된 위치에서 최선의 초점을 선택하면 결과적으로 에어리디스크가 비대칭이 되어 이미지 품질 저하로 이어집니다.비점수차는 저품질의 혹은 손상된 대물렌즈에서 중심이 맞지 않는 부품으로 인해 발생할 수 있으며, 현미경 광학 경로의 기타 오정렬에 의해 증가합니다.

넓은 관측 시야 이미징, 특히 조직 부분의 공초점 이미징의 주요 관심사는 필드 곡률이나 필드 평탄도로 설명되는 대물렌즈의 속성입니다.단순 구면 렌즈는 다른 영역의 이미지 포인트를 곡면 이미지 표면 위 플랫한 표본에 초점을 맞추며, 이는 렌즈 표면의 형태를 반영합니다.플랫 이미지 평면은 초점의 곡선 평면에 준하지 않기 때문에 필드의 중심 및 주변 영역에 대해 동시에 선명한 초점을 맞출 수 없습니다.여러 렌즈 요소 그룹으로 구성된 더욱더 복잡한 렌즈 설계가 필드 곡률의 보정과 선명한 초점의 중앙 부위 크기를 확장하는 데 필요합니다.평시야 혹은 플랜으로 지정된 대물렌즈는 광학적으로 보정되어 중간 이미지 평면에서 최소 필드 곡률로 중심에서 가장자리까지 선명한, 사용 가능한 필드를 만듭니다.최종 이미지 평면에서 필드의 평탄도는 현미경 접안렌즈 등 중간 광학 요소에 의존합니다.

이미지 필드의 중앙에서 가장자리까지의 배율의 비선형성은 표본 특성의 기하학적 왜곡을 만들어 이미지의 실제 차원적 측면이 왜곡되게 만듭니다.이러한 효과가 존재한다면, 교차된 선의 직교 집합이 이미지화될 때 쉽게 관찰되며 전체 이미지 필드에 대해 직선으로 나타나는 대신 선들이 필드 중앙에서 떨어진 영역에서 바깥쪽 혹은 안쪽으로 구부러집니다.이 두 가지 왜곡을 각각 배럴 왜곡과 핀쿠션 왜곡이라고 부릅니다.필드 곡률의 경우와 같이 소량의 기하학적 왜곡은 일반적으로 생물학 응용 분야에서 크게 중요하지 않지만 결함 분석이나 정밀한 측정을 의도한 경우 재료 과학 연구에서 중요할 수 있습니다.

색수차

파장 의존성을 나타내며, 다른 유형의 이미지 결함을 만드는 두 가지의 기본 광학 현상에 의해 색수차가 발생됩니다.색수차의 한 종류는 모든 광학 글라스에 대한 굴절률이 파장에 따라 달라져 발생하며 다른 종류는 파장에 따른 배율의 변화로 발생됩니다.일반적으로 분산이라 불리는 파장에 대한 굴절률의 의존성은 다양한 파장의 빛에 대한 효과적인 초점-길이 차이를 만듭니다.결과적으로, 단일 글라스로 구성된 단순한 렌즈의 경우 오직 하나의 파장 혹은 좁은 파장의 범위만이 특점 초점 설정을 갖는 이미지 평면에 정확히 초점을 맞출 수 있습니다.기타 파장들은 렌즈에서 더 가깝거나 더 멀리 초점이 맞춰질 것입니다.광축을 따라 일어나는 스펙트럼 분산을 종방향 색수차 혹은 축방향 색수차라 부릅니다(그림 5 참조).광축에 이미지화된 점과 같은 광원의 경우 굴절률의 변화는 렌즈에서 가장 가까운 곳에 청색광의 초점이 맞춰지며, 더 긴 파장은 렌즈에서 가장 먼 초점으로 수렴됩니다.수차가 보정되지 않는 경우, 이미지가 최적의 시각 초점의 어느 면으로 디포커싱될 때 수차가 다양한 색상 프린지로 시각화될 수 있습니다.

공초점 현미경 검사에 사용되는 대물렌즈의 보정되지 않은 종방향 색수차는 깊은 영향을 줄 수 있으며, 특히 두 개 이상의 형광단을 이미징할 경우 여러 파장에서 형광 방산의 공존을 나타내는 능력에 따라 좌우됩니다.다중 형광단이 사용되는 경우 종방향 색수차는 다양한 레이저의 여기 빔이 표본의 다른 포인트에 초점을 맞추게 하며, 비일치된 지점에서 다른 방사 파장을 유사하게 모으게 됩니다.이 수차는 3차원 표본 데이터 생성을 위해 z 방향 내 형광단의 정확한 위치를 설정할 가능성을 없앱니다.

스캐닝 공초점 기술에서 특정 대물렌즈를 위한 이미지의 무결성과 관련한 색수차 영향을 평가하려면 핀홀을 통과하고 검출기가 기록하는 신호 에너지를 결정하는 모든 요소를 고려해야 합니다.이러한 요소에는 레이저 방출 스펙트럼, 각 형광단의 방출 피크 및 대역폭, 검출기의 스펙트럼 민감도가 포함됩니다.종방향 색수차의 보정은 일반적으로 대물렌즈 디자인에서 다양한 광학적 특성을 가진 여러 렌즈 부품을 조합함으로써 달성되며, 보정의 정도는 대물렌즈를 다른 범주로 분류하기 위한 일부 기초를 형성합니다(밑에서 논의).

파장에 따른 렌즈 초점 길이의 변화는 종방향 색수차를 특징으로 갖는 축방향 분산을 생성하며 횡방향 색수차의 발생에도 영향을 줍니다(그림5 참조).배율은 초점 길이에 반비례하므로 파장에 따른 초점 길이의 변화는 파장에 대한 배율의 의존성으로 이어집니다.해당 수차가 대물렌즈에서 보정되지 않으면, 이미지의 모서리 둘레가 적색이나 청색의 프린지로 둘러싸일 수 있습니다.신호의 청색 파장 요소의 배율은 보정되지 않은 대물렌즈에서 적색 요소의 배율과 약 1~2% 정도 차이를 보일 수 있습니다.공초점 스캐닝 광학 시스템에 횡방향 색수차가 존재할 때 빛의 스펙트럼 구성에 따라 표본의 위치보다 방출된 빛이 실제보다 광축에 더 가깝거나 더 먼 위치에서 이미징될 가능성이 있으므로 핀홀에서 신호 손실을 일으킬 수 있습니다.

두 유형의 색수차가 연관되어 있기 때문에 종방향 색수차에 대해 고도로 보정된 대물렌즈에서는 일반적으로 최소화된 횡방향 색수차를 나타냅니다.현미경의 광학 성능에 영향을 미치는 다양한 요소를 보정하기 위해 현미경 제조업체는 다양한 접근 방법을 사용하며, 시스템 구성 요소의 신중한 매칭은 수차를 최대한으로 보정하는 데 필수적입니다.공초점 형광 현미경 관찰에서, 다른 파장에서 방출하는 형광단의 위치를 매핑하는데 오류가 생긴다는 점에서 보정되지 않은 횡방향 색수차 또한 비슷한 문제로 이어집니다.

광학 현미경 제조 역사 중 많은 부분에서, 접안렌즈의 전면 초점면에 해당하는 대물렌즈 장착면으로부터 지정된 고정 거리에 실제 이미지를 형성하도록 하는 대물렌즈 설계 표준을 따랐습니다.대물렌즈에 의한 실제 중간 이미지의 직접적 형성에 기반한 장치를 유한 시스템이라 하며, 중간 이미지까지의 거리를 대물렌즈의 튜브 길이라 부릅니다.여러 제조업체는 한때 유한 광학 시스템을 동일 튜브 길이와 동초점 거리를 갖도록 표준화하였으나, 렌즈 수차를 보정하기 위해 다른 접근 방식이 사용되었으며 다른 제조업체의 광학 구성 요소를 조합하는 경우 이러한 요소들이 고려되어야 합니다.유한 시스템은 대물렌즈에서 완전한 수차 보정을 제공하도록 설계될 수 있거나, 알려진 횡방향 색수차의 잔류 수준이 보정 접안렌즈에 의해 보완되는 대물렌즈가 형성하는 이미지에서 허용될 수 있습니다.

무한 광학 시스템에서 대물렌즈에서 출발한 빛은 초점이 맞춰지지 않지만, 때로 텔란(Telan) 렌즈라 불리는 튜브 렌즈가 중간 이미지 평면에 수렴할 때까지 평행을 유지합니다.주요 현미경 제조업체 대부분은 무한 보정 광학 시스템을 개발하였으며, 이는 초점이 무한으로 맞춰진 물체에서 광선이 물체와 튜브 렌즈 사이의 ‘무한한 공간’에 배치된 추가 광학 부품에 상대적으로 둔감하다는 본질적인 이점을 가집니다.튜브 렌즈가 잔류 수차를 일부 보정할 수 있으나, 튜브 렌즈가 광학적으로 중립적이기 때문에 대물렌즈 내에서 완전한 보정을 제공하는 설계의 다양성에 장점이 있습니다.그림6에는 전형적인 직립 및 도립 형광 현미경을 위한 무한 광로가 설명되어 있습니다.각 현미경 다이어그램의 쌍촉의 흰 화살표는 대물렌즈 후방 조리개와 튜브 렌즈 사이의 평행 광선 경로를 가리킵니다.

다양한 제조업체는 무한 시스템에서 튜브 렌즈 초점 길이와 무한 공간 길이 등 다양한 설계 사양을 준수합니다.무한 보정 광학 시스템은 초점을 맞추기 위해 현미경 스테이지 대신 물체를 이동할 수 있게 하며, 이는 관찰 중에 표본을 섬세하게 조작해야 하는 응용 분야에 뚜렷한 이점으로 작용합니다.그러나, 무한 공간의 실제적인 주요 이점은 편광 분석기, 필터, 차등 간섭 대비(DIC) 프리즘 등 보조 광학 장치를 굴절 특성이나 두께를 두고 크게 걱정하지 않고 추가할 수 있다는 것입니다.평면 평행 표면에 있는 한, 추가된 요소는 이미지 품질에 거의 영향을 끼치지 않습니다.대조적으로, 광학 부품은 추가된 요소의 두께와 굴절률에 따라 변화하는 이미지 이동과 기타 수차의 도입 없이 대물렌즈의 이미지 평면과 중간 이미지 평면 사이에 수렴하는 유한 보정 시스템의 빔 경로에 배치될 수 없습니다.

현미경 대물렌즈의 광학 보정

유한 또는 무한 보정 광학 시스템의 사용 여부와 상관없이, 시스템을 위해 설계된 대물렌즈의 결합된 성능 기준은 특정 이미징 기술의 요구 사항을 충족할 대물렌즈를 결정하는 데 고려되어야 합니다.대물렌즈는 일반적으로 광학 보정 정도에 따라 성능 범주로 분류됩니다.논의한 바와 같이, 다양한 수차의 상대적 중요성과 영향을 주는 성능 기준은 대물렌즈가 사용되는 방식과 응용 분야의 필수 요구 사항에 따라 좌우됩니다.대물렌즈의 가장 일반적인 분류는 일반적으로 대물렌즈의 색수차 보정 정도를 기준으로 하나, 기존의 대물렌즈 범주는 광학 설계와 제조에서의 상당한 기술적 발전 덕분에 최근 훨씬 덜 뚜렷해졌습니다.대부분의 기술적인 명명법은 여전히 유효하며 널리 사용되고 있고, 사용할 수 있는 다양한 대물렌즈를 평가할 때, 사용되는 용어와 공초점 응용 분야와 관계가 있는 방식을 이해하는 것이 중요합니다.

색수차는 렌즈를 제작하는 데 사용되는 광학 글라스에서 일어나는 분산의 결과이며, 일반적으로 다양한 분산적 특성을 갖는 렌즈 요소를 혼합하여 사용함으로써 보정됩니다.전통적으로 색수차 보정이 최소화된 대물렌즈는 아크로매트로 분류되며(그림7 참조), 일반적으로 ‘평균적인’ 분산 글라스를 사용하여 구성됩니다.이러한 유형의 유리에는 크라운 유리와 플린트 유리가 포함되며, 파장이 증가하면 굴절률이 거의 선형적으로 감소합니다.크라운 유리는 낮은 굴절률과 분산을 보이며, 이는 일반적으로 높은 굴절률과 분산을 보이는 플린트 유리와 대조적입니다.구형 아크로매트 대물렌즈는 적색광과 청색광을 공통 초점으로 가져오는 색수차와 녹색광의 구면수차를 보정하기 위해 이러한 글라스 유형의 두 가지 이상의 렌즈 요소를 결합하였습니다.현대의 아크로매트 대물렌즈는 일반적으로 구면수차를 추가적으로 보정하고 필드 곡률에 상당한 보정을 가합니다.대물렌즈가 모든 이미지 필드에서 필드 평탄도를 확대하도록 보정될 경우 플랜 아크로매트라 불립니다.일반적으로 아크로매트 대물렌즈는 기존의 명시야 육안 관찰과 필드 곡률을 추가적으로 (플랜) 보정하는 현미경 사진 촬영과 디지털 이미징에 적합합니다.

대물렌즈에 향상된 색수차 보정을 달성하려면 스펙트럼의 일부에서 비정상적인 분산이 이루어지는 유리 유형이 필요합니다.적색 혹은 청색 스펙트럼 영역에서 파장을 갖고 굴절률의 비선형적 변화를 보이는 유리에서 색수차를 상쇄하여 둘 이상의 파장에 동시 초점을 가능하게 할 수 있습니다.결정체 플로라이트는 아크로매트로 얻은 이미지를 특징짓는, 날카로운 모서리에 접한 녹색이나 자색의 프린지를 담당하는 보정되지 않은 이차 스펙트럼 감소에 적합한 광학적 특성을 제공한다고 밝혀진 최초의 물질 중 하나였습니다.다양한 광학 글라스와 결합하여 플로라이트 요소는 세 파장(색)의 색 렌즈 수차와 두 파장의 구면 수차를 보정할 수 있습니다.더불어, 이러한 고도로 보정된 대물렌즈는 자외선 스펙트럼 영역에서 전송 특성을 향상시켰습니다.

더욱 최근에 일어난 기술 개발 덕분에 플로라이트 장치와 비슷한 분산 특성으로 이어지는 렌즈 제형, 및 새로운 렌즈 형태를 제작하게 되었으며, 대부분의 제조업체는 가장 높은 범주의 광학 보정에 근접하게 되는 일련의 플로라이트 대물렌즈를 생산합니다.이러한 대물렌즈는 세미 아포크로매트라 불리며 플로라이트 장치를 포함할 수도 그렇지 않을 수도 있지만, 광학적 특성 때문에 Fl 및 PlanFl 등의 이름으로 다양한 제조업체에 의해 규정됩니다.해당 범주에 속한 현재의 대물렌즈는 여러 이멀젼 매체와 함께 사용하기 위한 모델 등 많은 구성에 사용 가능하며 일부 공초점 및 다중 광자 응용 분야는 물론 차등 간섭 대비, 편광, 위상차, 형광, 명시야에 사용하는 데 적합합니다.

아포크로매트로 분류되는 대물렌즈는 일반적으로 색수차 및 구형 수차에 대하여 가장 높은 수준의 보정을 수행합니다(그림7 참조).이러한 대물렌즈는 일반적으로 주어진 배율에서 가장 높은 사용 가능한 개구수를 가지며, 색수차와 구면수차는 최소 세 가지 파장에 따라 보정됩니다.완벽에 가까운 수차 보정으로 색수차 및 구면 수차를 없앤 대물렌즈는 일반적으로 모든 현미경 기술에 적합하나, 사용 중인 기술에 대한 특정 성능 요구 사항도 고려되어야 합니다.아포크로매트의 우수한 광학적 보정에도 3중이나 2중 렌즈 요소를 사용하므로 개구수나 평탄도 등 기타 주요 사양을 타협할 수 있습니다.더 새로운 상업적 제조 기술로 초박형 렌즈 부품을 실현하는 새로운 렌즈 폴리싱 기술을 통해 이러한 문제를 극복했습니다.이러한 대물렌즈는 초박형 볼록 렌즈와 오목 렌즈를 결합하여 자외선에서 근적외선까지의 스펙트럼 범위에서 색수차 보정과 더 높은 투과율, 높은 개구수, 확장된 평탄도를 이루었습니다.

공초점 형광 응용 분야는 여기 파장과 방사 파장에서 대물렌즈 수차가 유사하게 보정되지 않으면 심각하게 제한될 가능성이 있으며 다중 형광단이 사용되거나 여기 파장과 방사 파장 간 차이가 클 경우 요구 사항을 충족하기 어려워집니다.최대 검출 광자 에너지를 얻기 위해서, 조명 지점과 핀홀에서 촬영된 검출 영역 간의 동초점이 유지되어야 합니다.많은 아포크로매트 대물렌즈도 자외선 여기과 가시 영역 방출을 결합한 적절한 형광 기술 보정을 제공하지 않습니다.이는 공초점 시스템에 비용과 상당한 운영 복잡성을 더하지만, 대물렌즈가 넓은 범위의 파장을 수용하는 데 실패한 경우, 이를 보상하기 위해 추가적인 광학 구성 요소가 자외선 레이저원에 사용될 수 있습니다.

고성능 워터 이멀젼 대물렌즈와 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈는 생세포 이미징 연구 영역의 요구 사항을 충족하기 위해 특별히 디자인되었습니다.주요 목표는 생리학적 매체로 지원되는 생세포와 조직 등 생물학 표본을 공초점 형광 현미경으로 관찰할 때 최적의 성능에 도달하는 것입니다.대물렌즈 설계에 통합된 수차 보정의 수준과 상관없이 설계의 작동 요구 사항을 위반함으로써 외부의 광학 경로에 추가 수차가 도입될 수 있으며, 최상의 구성 요소 성능이 저하될 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다.

워터 디핑이나 직접 이멀젼을 위해 설계된 대물렌즈는 특수 세라믹이나 고분자 노즈콘을 특징으로 하며 생세포와 생리학 연구에 사용될 수 있습니다.이러한 연구는 측정이나 기타 조작을 위해 표본에 접근해야 하지만, 커버 글라스를 제자리에 두고 수행할 수는 없습니다.일반적으로 워터 디핑 대물렌즈는 플로라이트 범주에 속하며 자외선과 적외선 스펙트럼 영역에서 투과율이 높고 작동 거리가 길고 대물렌즈 노즈 부위의 삽입(디핑) 부분이 좁게 설계됩니다.대물렌즈의 더 작은 각진 노즈는 미세전극을 부착하기 위해 표본에 최대한 접근하거나 관찰하는 도중 다른 작업을 수행하기 위한 것입니다.이러한 유형의 일부 대물렌즈에서 수 밀리미터일 수 있는 긴 작동 거리 또한 표본에 대한 접근성을 높입니다.많은 디핑 대물렌즈의 이멀젼 부위는 전기 절연 및 화학적 저항을 위해 세라믹이나 기타 불활성 절연 재료로 구성됩니다.특성의 조합은 워터 디핑 대물렌즈를 살아 있는 표본의 공초점, 다중 광자, 그리고 여러 다른 이미징 방법론에 적합하게 합니다.

배율, 개구수, 광학 보정 정도와 더불어, 대물렌즈의 작동거리는 공초점 현미경 및 3차원 표본 정보를 얻는 데 사용되는 다른 디지털 현미경 기술에서 특별히 중요합니다.커버 글라스가 필요한 대물렌즈를 위한 작동 거리는 커버 글라스에 닿은 표본 평면에 초점이 맞춰졌을 때 커버 글라스의 상단 표면과 전면 렌즈 요소 사이의 거리로 정의됩니다(그림9(b)).해당 거리는 대물렌즈가 커버 글라스 상단에 닿기 전 도달할 수 있는 최대 초점 투과 깊이를 결정하므로 공초점 이미징이 표본의 다양한 깊이에서 수행될 때 이러한 거리가 중요합니다.그러므로, 이 작동 거리는 z 축을 따라 표본 데이터가 수집될 수 있는 범위를 제한합니다.

일례로, 작동 거리가 0.20mm(200㎛)인 대물렌즈는 커버 글라스 상부 표면에 대물렌즈가 닿기 전 커버 글라스 밑 최대 깊이인 200㎛에 초점을 맞출 수 있습니다.작동 거리는 배율, 개구수 및 광학 보정이 증가함에 따라 일반적으로 줄어들지만, 해당 한도 내에서는 광학 설계에 따라 다릅니다.긴 작동 거리로 큰 개구수 및 높은 수차 보정을 유지하는 것은 렌즈 요소의 형태와 고도로 보정된 대물렌즈에 필요한 수에 부과되는 간단한 기하학적 제약으로 제한됩니다.현재 사용 가능한 대물렌즈의 사양은 개선된 광학 글라스와 렌즈 코팅, 컴퓨터 설계 기능의 가용성에 의해 실현되어, 성능 면에서 놀라운 성과를 이뤘습니다.

신호 강도가 개구수의 제곱에 비례한다는 사실은 공초점 현미경 검사를 위한 최적의 대물렌즈를 선택하는 데 영향을 주며, 경우에 따라 다양한 성능 요소의 상대적 중요성을 변화시킵니다.스캔 줌 기능이 있는 스캐닝 공초점 시스템을 활용할 때, 100X 광학 배율을 사용할 필요가 거의 없으며, 높은 개구수와 고도로 보정된 40배율 및 60배율 대물렌즈가 더 적합할 수 있습니다.더 낮은 스캔 줌을 사용하여 넓은 관측 시야 이미지를 얻고 더 높은 스캔 줌을 사용하여 고분해능 하위 세포 구조 이미지를 얻을 수 있습니다.

면역 형광 이미징 등 여러 유명 기술은 광학 시스템의 전송 특성이 매우 중요할 정도로 낮은 조도 때문에 본질적으로 어려움을 겪습니다.미세한 표본 세부 사항의 검출에는 소수의 광자만 사용할 수 있으며 결과적으로 형광단 여기 파장이나 방사 파장에서 상대적으로 미세한 투과율 차이가 라벨링된 특징의 검출 가능성을 결정하는 데 중요할 수 있습니다.일부 경우에서 임계 파장 대역에서 광 손실을 증가시킬 수 있는 추가적인 렌즈 요소와 코팅이 필요한 필드의 평탄도, 수차 보정 등의 다른 사양보다 대물렌즈의 투과 특성이 더욱 중요할 수 있습니다.그러나 광학 기술의 진보는 독특한 렌즈 기술을 통해 이 투과율 타협을 피합니다.

세포 및 분자 생물학, 기타 분야의 문제에 적용되는 전문 기술의 수는 특히 현미경 대물렌즈와 관련하여 광학 이미징 시스템을 향한 수요에 변화를 불러왔습니다.레이저 트래핑, 다광자 여기, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 형광제자리부합법(FISH), 적외선 차등 간섭 대비가 새로운 요구 사항을 불러왔으나, 생물학 표본의 3차원 연구를 위한 공초점 스캐닝 기술 사용이 크게 증가하면서 상업적으로 개발된 제품에 큰 영향을 미쳤습니다.전문 기술의 여러 매개 변수는 기존의 특정한 객관적 성능 기준이 다른 더 중요한 사양을 개선하기 위해 부분적으로 희생될 수 있다는 사실을 명확히 했습니다.반사 방지 코팅 기술뿐 아니라 컴퓨터 보조 렌즈 설계, 광학 글라스 제형의 극적인 발전으로 기존의 광시야 현미경에서 절충점이 거의 없고, 새로운 요구 사항을 충족할 수 있는 개선된 광학 장치를 도입했습니다.일례로, 향상된 자외선 및 적외선 투과성을 지닌 대물렌즈, 구면수차 보정환, 증가된 작동 거리, 더 높은 개구수의 고성능 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈 등이 있습니다.더불어, 초박형 렌즈로 제조된 대물렌즈는 연구자들이 이러한 사양의 손상 없이 높은 개구수와 투과율, 더 넓은 스펙트럼의 색수차 보정과 확장된 평탄도를 달성할 수 있게 합니다.

현대의 많은 대물렌즈는 설계 사양에 따라 사용될 때 공초점 현미경에 적합합니다.레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용한 두꺼운 수성 표본의 고분해능 검사와 정확한 3차원 이미징은 매우 어렵고, 효율적인 형광 수집을 위한 높은 개구수, 최대 투과 깊이를 가능하게 하는 긴 작동 거리, 정확한 3차원 재구성을 위한 평시야, 다중 형광단 이미지의 동초점을 위한 낮은 축방향 색수차, 다중 형광 이미지의 정밀한 등록을 가능하게 하는 낮은 횡방향 색수차, 여기 및 방사 파장에서의 높은 전송률과 같은 기준을 모두 충족하는 대물렌즈가 필요합니다.