공초점 현미경용 레이저 시스템

레이저 스캐닝 공초점 현미경에 일반적으로 사용되는 레이저는 고강도 단색 광원으로, 광학 포획, 수명 이미징 연구, 광표백 회복 및 내부 전반사 형광(TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence)을 포함한 다양한 기법을 위한 도구로 유용합니다.또한, 레이저는 스캐닝 공초점 형광 현미경의 가장 일반적인 광원이며, 빈도는 적지만 기존의 광시야 형광 검사에 사용되어 왔습니다.

레이저는 간섭성을 띠는 강렬한 단색광 패킷을 방출하는데, 이는 레이저 광이 시공간에서 동위상이고, 시준되거나 좁아지면서 매우 낮은 팽창률로 조밀한 빔을 형성할 수 있음을 의미합니다.다른 광원에 비해, 레이저에서 방출되는 극히 순수한 파장 범위는 텅스텐-할로겐램프, 아크 방전 램프 또는 LED 조명 엔진과는 비교할 수 없는 대역폭과 위상 관계를 갖습니다.결과적으로, 레이저 광 빔은 먼 거리를 이동할 수 있으며 조리개를 채우기 위해 확장되거나 높은 수준의 밝기로 매우 작은 지점에 초점을 맞출 수 있습니다.이득 매질(광원), 여기원(전원 공급 장치) 및 전기 공진기를 포함하는 모든 레이저에 공통적인 유사성 외에도, 이러한 광원은 크기, 비용, 출력 전력, 빔 품질, 소비 전력 및 작동 수명 측면에서 근본적으로 다릅니다.

대부분의 레이저 시스템에서 생성되는 단색광의 간섭성은 기존의 광시야 현미경에 이러한 광원을 적용할 때 문제를 야기합니다.광 산란 및 회절 패턴은 광학 경로의 모든 표면에서 간섭에 의해 도입됩니다.또한, 먼지뿐만 아니라 시야와 조리개 다이어프램도 아티팩트를 생성합니다.이러한 바람직하지 않은 효과는 다양한 기법을 통해 최소화하거나 제거할 수 있습니다.가장 일반적인 방법에는 광원과 현미경 사이의 광학 경로 길이를 빠르게 변화시킴으로써 레이저 광을 일시적으로 스크램블링하거나, 공초점 현미경 시스템의 경우에서처럼 시편을 점 단위로 스캐닝하는 것이 포함됩니다.또한, 이 조리개 스캐닝 기법으로 종종 간섭 및 기타 아티팩트를 제거할 수 있습니다.레이저 빔의 경로 길이 또는 간섭성 상태가 검출기 통합 시간(사실상 비디오 프레임 속도)보다 더 빠른 간격으로 변동할 경우, 스펙클 및 산란 아티팩트가 이미지에서 사라집니다.

아르곤 이온 레이저 광원으로 생성된 미분 간섭 대비(DIC) 이미지를 개선하기 위해 일부 연구원들이 한 기법을 채택하여 성공을 거두었는데, 이 기법은 바로 광 경로에 분당 2,500rpm으로 회전하는 원형 유리 웨지를 배치하는 것입니다.확장된 레이저 빔 앞에서 웨지가 회전할 때 웨지 두께의 차이로 인해 광학 경로 길이에 급격한 변화가 발생합니다.현재, 경로 길이 변화는 일반적으로 광섬유 광 파이프를 사용하여 광원과 현미경 사이에 빛을 보냄으로써 이루어집니다.광섬유를 진동시키면 광학 경로 길이가 계속해서 변화하고, 이로 인해 빔이 진동 레벨보다 낮은 주파수에서 일시적으로 간섭성을 잃게 됩니다.진동은 레이저 헤드에 사용되는 압전 장치, 확성기 또는 냉각 팬에 의해 생성될 수 있습니다.

그림 1에 나와 있는 것은 자체 모드 잠금 티타늄 사파이어 펄스 레이저로, 현재 대부분의 다광자 형광 현미경 검사에서 선호되는 레이저 여기원 중 하나입니다.티타늄 사파이어 모드 잠금 레이저는 약 690나노미터에서 1,050나노미터 이상의 넓은 파장 가변 범위를 제공하며, 펄스폭은 약 100펨토초 길이입니다.또한, 이러한 레이저는 대부분의 형광단에서 이광자 여기의 포화에 충분한 전력(가변 범위 전체에 걸쳐 100밀리와트 이상)을 가지고 있습니다.레이저 크리스털의 적절한 냉각 및 습도 제어를 보장하기 위해 실링 처리된 레이저 헤드에 질소 가스가 펌핑되며, 외부 냉각기를 통해 항온 상태로 유지됩니다.

많은 레이저 시스템에서 생성되는 광은 수직 방향의 편광 벡터를 통해 선형으로 편광됩니다.이런 특성은 미분 간섭 대비, 편광 광 측정 또는 형광 편광 이방성의 정량적 조사와 같은 편광 조명원을 필요로 하는 응용 분야에서 활용될 수 있습니다.

레이저 빔의 간섭성과 편광 특성은 레이저의 출구 미러로부터의 거리가 증가함에 따라 변화하는 빔 단면 또는 프로파일의 광 분포에 의해 측정됩니다.레이저 빔 특성에 대한 다음의 논의는 현미경 이미징, 레이저 포획 및 기타 응용 분야에서 레이저를 사용할 때의 유용성을 증명할 수 있는 주제에 대한 일반적인 개요로 제시됩니다.

레이저가 TEM(00) 모드라고 하는 가장 단순한 횡방향 전자기파 모드에서 작동할 때, 방출된 빔은 평면 파면과 가우시안 강도(방사 조도) 프로파일을 갖습니다.레이저 빔 직경은 일반적으로 강도가 피크 값의 e(E-2)(13.5%)로 떨어진 값으로 정의됩니다.레이저 빔의 가우시안 프로파일은 회절로 인해 발생하는데, 이는 완벽하게 시준된 빔의 전파를 방해하고 광파의 횡방향 확산을 유도합니다.레이저 출력 조리개 근처(근거리장이라 함)에서는 빔의 위상 전면이 무질서해질 수 있습니다.결과적으로, 빔 단면 형상, 크기 및 방사 조도 프로파일이 레이저로부터의 거리에 따라 빠르게 변화합니다.더 먼 거리(원거리장)에서 위상 전면은 결과 가우시안 프로파일로 안정화됩니다.일부 참고용 문헌 자료에서는 근거리장과 원거리 장을 각각 프레넬 영역 및 프라운호퍼 영역이라는 대체 용어로 지칭합니다.근거리장은 또한 레일리 범위라 표현하기도 합니다.근거리장은

z = A⁰₂/λ로 정의된 거리 z에서 시작하며

여기서 A(0)은 출구 조리개에서의 빔 직경이고 λ는 레이저가 방출하는 광의 파장입니다.이 방정식을 488나노미터의 파장에서 0.6밀리미터 웨이스트 직경의 빔을 방출하는 아르곤 레이저에 적용할 경우, 원거리장은 출구 조리개로부터 약 74센티미터에서 시작됩니다.

그림 2는 근거리장 및 원거리장에서의 레이저 빔의 기하학적 구조와 발산에 대한 개략도입니다.위에서 설명한 대로, 빔은 본질적으로 근거리장에서는 거의 확산하지 않는 파면의 평행 묶음으로 간주될 수 있습니다.근거리장을 넘어서면, 빔의 중심에서 가장자리(e(E-2))까지 측정되는 빔 발산 각(θ)은 더 커지며 다음 방정식에 따라 빔 직경(D)를 결정하는 데 중요한 매개 변수가 됩니다.

빔 직경(D) = 2L • tan(θ)

여기서 D는 레이저 빔 직경을 나타내는 변수이고 L은 레이저 출구 조리개에서 빔의 측정 지점까지의 거리 길이를 나타냅니다.실제로, 방사 조도 프로파일을 포함한 여러 레이저 빔 특성은 많은 현미경 응용 분야에서 중요한 요소이며, 이미징 시스템을 구성할 때 원거리장까지의 거리에 대한 지식이 필요할 수 있습니다.표 1은 흔히 사용되는 여러 레이저, 방출선 및 일반적인 빔 웨이스트 직경에 대해 이 거리를 계산한 값(위에 주어진 방정식 사용)을 보여줍니다.

원거리장까지의 거리

표 1

빔은 흔히 집속되고 형상을 잡거나, 렌즈 및 다른 광학 구성 요소에 의해 달리 수정되어야 하기 때문에 빔이 가우시안 특성을 나타내는지 여부는 대부분의 레이저 응용 분야에서 중요합니다.가우시안 빔은 특정한 정의 가능 변환 특성을 갖고 있으며 이러한 특성을 사용해 빔이 어떻게 광학 시스템을 통해 전파되는지에 대한 가정을 내릴 수 있습니다.

원거리장에서 가우시안 빔의 각도 반경(또는 빔 발산 각, 그림 2 참조)은 θ(라디안 단위)으로 지정되며 다음 식으로 근사됩니다.

θ = λ /Ï€a₀

여기서 a(0)은 레이저 출구 조리개에서의 빔 웨이스트 반경입니다.빔 웨이스트 직경은 레이저 파장, 공동 길이 및 공동의 기타 설계 매개 변수의 함수입니다.레이저로부터의 거리(z)가 증가함에 따라 빔 웨이스트 반경은 다음 방정식으로 얻어집니다.

a(z) = θ_z

일반적으로 레이저 빔은 M의 제곱 또는 K(M 제곱의 역수에 해당)와 같은 빔 전파 매개 변수에 의해 특징지어지며, 다음과 같이 근거리장 및 원거리장 측정의 조합으로 결정됩니다.

M²= Ï€A₀θ/4λ

전파 상수 또는 전파 계수라고 하는 M2의 값이 작을수록, 특히 직경과 발산이 작을수록 빔 품질이 높음을 의미합니다.계수는 이상적인 가우시안 빔에 대한 실제 빔의 관계를 설명합니다.

간섭성 가우시안 빔은 렌즈와 미러에 의한 전파 및 변환에서 비간섭성 광 빔과의 차이를 야기하는 특정한 성질을 갖습니다.회절 제한 빔의 경우, 가우시안 빔의 강도 프로파일은 빔이 렌즈 조리개에 의해 잘리지 않는 한 그 자체가 가우시안입니다.가우시안 빔 직경이 렌즈 조리개 직경의 1/2이면, 출사 빔의 강도 프로파일은 가우시안으로 유지됩니다.가우시안 빔 직경이 렌즈 조리개 직경과 같으면, 출력 빔 강도 프로파일은 가우시안 함수와 에어리 원반(Airy disk) 함수의 혼합입니다.마지막으로, 렌즈 조리개의 직경보다 훨씬 큰 가우시안 빔 직경은 에어리 원반의 출력 프로파일을 생성합니다.후자의 경우 렌즈 입구 조리개의 과충전으로 인해 상당한 양의 레이저 전력이 손실될 수 있습니다.

가우시안 빔 광학의 전반적인 주제는 수많은 교과서에서 상세하게 다루고 있으며, 여기서 설명되지 않은 세부 사항은 보다 포괄적인 정보를 담은 출처에서 얻을 수 있습니다.두 가지 유형의 가우시안 빔 조작은 레이저, 빔 집중 및 빔 확장을 활용하는 현미경 사용자들이 특히 관심을 가질만한 부분입니다.

레이저 빔이 무수차 현미경 대물렌즈에 의해 매우 작은 지점에 집속되면(빔 집중) 집속(거리 z에서) 지점의 반경은 다음 식으로 얻어집니다.

a(z) = λf/Ï€a₀

여기서 f는 렌즈의 집속 길이입니다.개구수가 1.3인 100배율 대물렌즈(약 1.6밀리미터의 집속 거리 생성)를 사용하여 반경이 0.3밀리미터인 아르곤 레이저의 488나노미터 빔을 집중시키는 경우, 집속 지점 반경(이전 방정식에서 결정됨)은 0.8마이크로미터입니다.빔 확장(아래 설명)을 통해 빔 웨이스트를 5배 증가시키면 집속 지점 반경은 약 0.16마이크로미터가 됩니다.

매우 높은 전력 밀도는 집중된 레이저 빔의 집속점에서 달성된다는 사실에 주목하는 것이 중요합니다.직경 0.22마이크로미터의 회절 제한 지점에 집속된 10밀리와트 빔은 제곱센티미터당 약 3천만 와트의 전력 밀도를 생성합니다.이러한 높은 에너지 수준은 렌즈 및 필터 코팅을 급속도로 분해하거나 손상시킬 수 있을 뿐만 아니라 생물 시편에 상당한 광화학적 손상을 일으킬 수 있습니다.그러나 그런 미세한 지점 크기의 경우, 물에서 열에너지가 매우 효과적으로 확산되므로 고에너지 근적외선 빔은 시편에서 에너지 흡수량이 충분히 높지 않은 한 생물 시편에 거의 손상을 주지 않을 수 있습니다.

광학 현미경에서의 많은 레이저 응용에서, 레이저 빔은 처음에 실제로 역방향 망원경인 케플러 또는 갈릴레이 빔 익스팬더를 사용하여 확장됩니다(일반적인 레이저 빔 익스팬더의 구조적 특징은 그림 3 참조).간섭성 가우시안 빔의 발산을 줄일 수 있으며, 레이저 빔이 먼저 확장되면 빔이 더 긴 거리에 걸쳐 최적으로 시준됩니다.이전 방정식을 참조하면, θ로 지정된 빔의 각도 반경은 레이저 출구 조리개에서 빔 웨이스트 반경 a(0)에 반비례합니다.따라서, 빔 웨이스트 반경을 확장하면 그에 비례하여 발산이 줄어듭니다.

유연한 광섬유를 통해 현미경 광학 경로로 직접 레이저 출력을 파이핑하는 것이 여러 현미경 응용 분야에서 실용적입니다(그림 4 참조).이 기법은 레이저와 현미경을 견고하게 정렬하기 위해 대형 무진동 광학 테이블, 많은 수의 고정 미러 및 기타 구성 요소를 사용해야 하는 대체 방법보다 선호됩니다.

레이저 빔이 렌즈에 의해 광섬유에 집속될 때, 섬유에서 나오는 빔의 결합 효율과 특성은 섬유의 기하학적 구조에 따라 크게 달라집니다.레이저 광 전달에 사용되는 대부분의 광섬유는 용융 실리카 코어로 구성됩니다.이러한 섬유는 굴절률이 높은 실리카로 제작되고 굴절률이 낮은 소재로 이루어진 클래딩이라고 하는 슬리브로 둘러싸인 내부 코어로 구성됩니다.따라서 코어 및 클래딩의 경계면에서 내부 전반사에 의해 광이 섬유의 길이를 따라 빠져나가는 것을 막을 수 있습니다.클래딩은 실리카, 유리, 경질 플루오로폴리머 또는 연질 실리콘으로 구성될 수 있습니다.

광섬유는 내부 코어의 직경에 따라 단일 모드 또는 다중 모드로 분류됩니다.단일 모드 섬유는 하나의 특정 파장에서 가장 낮은 차수의 모드만 전파할 수 있습니다(그림 4).전파되는 파장 및 파의 편광 보존은 섬유 직경에 의해 결정됩니다.다른 파장이 전파될 수 있지만 효율성이 떨어집니다.일반적인 단일 모드 섬유 직경 범위는 가시광선 파장의 경우 3~6마이크로미터이며 단일 모드 섬유의 출력 방사 조도 프로파일은 가우시안입니다.

다중 모드 광섬유는 하나 이상의 모드를 전파할 수 있게 하며 단일 파장으로 제한되지 않습니다.다중 모드 광섬유의 내부 코어는 단일 모드 섬유보다 더 커서 직경 범위가 약 100마이크로미터에서 1.2밀리미터에 이릅니다.다중 모드 섬유의 출력 방사 조도 프로파일은 탑-햇 프로파일이라고 하는 평평한 형상으로, 개구수는 코어 및 클래딩 굴절률에 의해 결정됩니다.

섬유 코어의 수용 원뿔 각도 θ는 다음과 같이 섬유의 개구수(NA)와 관련됩니다.

NA = sin θ/(n²core - n²cladding)^1/2

여기서는 굴절률을 나타냅니다.섬유 코어 개구수와 빔 집중 렌즈의 개구수가 일치하면 레이저 광이 섬유 코어에 효율적으로 결합됩니다.광섬유를 통한 광 투과의 효율은 일반적으로 약 90% 정도로 높지만, 반경이 매우 작은(3센티미터 미만) 굴곡으로 인해 급격히 감소할 수 있습니다(단, 60 또는 70%까지).

레이저를 사용할 때는 직접 또는 정반사된 레이저 광이 관찰자의 눈에 들어가지 않도록 하는 것은 물론, 빔이 광학 시스템의 구성 요소에서 레이저 시스템으로 다시 반사되는 것을 방지하는 것도 중요합니다.레이저 광이 관찰자의 눈에 들어가지 않게 하는 것은 확실한 개인 안전 예방 조치이며, 빔이 시스템으로 다시 반사되지 않게 주의하는 것은 추가 반사기가 간섭성 빔을 레이저로 되돌려 시스템을 손상시킬 가능성을 방지하는데 중요합니다.

레이저 광원의 안정성은 여러 응용 분야에서 중요한 측면입니다. 특히 정량적 현미경 검사에서 중요한데, 광도 변동이 실험 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.유도 방출 및 공동 길이 변동과 관련된 여러 요인은 출력 빔에 주파수 노이즈를 유발할 수 있지만, 진폭 변동을 야기하는 다른 섭동은 고주파 강도 노이즈와 광학 출력 전력의 느린 변형(드리프트)을 모두 생성할 수 있습니다.이러한 강도 변동의 몇 가지 원인은 레이저 헤드 자체 또는 전원 공급 장치의 기능과 관련됩니다.다양한 레이저 범주의 출력 빔에서 가장 일반적인 노이즈 소스는 다음과 같습니다.

• 가스 레이저 - 공진기 진동으로 인한 미러 정렬 불량, 광학 펌프 소스의 노이즈, 플라스마 진동 및 이온 방전 프로세스의 불안정성, 전원 공급 장치 전류의 변동, 냉각수 난류로 인한 마이크로포닉스 및 강제 공랭 시스템의 팬 유도 노이즈는 모두 잠재적인 노이즈 소스입니다.
• 고체 레이저 - 노이즈 소스에는 마이크로포닉스, 램프 및 다이오드 펌프에 대한 펌스 소스 변동, 공동 정렬 오류 및 레이저 매질의 열 변동과 관련된 무작위 주파수 관련 노이즈(1/f 노이즈라고 함)가 포함됩니다.
• 색소 레이저 - 노이즈(고주파)와 드리프트는 모두 염료 용액의 밀도 불균질성과 기포, 염료 펌프 및 레이저 펌프 소스 불안정성으로 인해 발생합니다.
• 반도체(다이오드) 레이저 - 노이즈는 구동(바이어스) 전류 또는 온도의 변동으로 인해 발생할 수 있으며, 1/f 노이즈는 접합부의 캐리어 트래핑 및 기타 유형의 캐리어(전자 정공) 재결합 효과로 인해 발생합니다.

모든 레이저는 전원 공급 장치에서 발생하는 노이즈에 취약합니다.효율성과 작은 크기로 인해 일반적으로 사용되는 스위칭 전원 공급 장치는 특히 수십 킬로헤르츠에 이르는 주파수로 레이저 시스템에 리플을 야기할 가능성이 높습니다.그러한 간섭은 광학 현미경 시스템의 광 빔에 영향을 미치는 경우 진단 및 제거에 특히 문제가 될 수 있습니다.주된 어려움은 다른 소스(예: 실험실 환경의 전자기장)에 의해 시스템에 유입되는 노이즈와의 유사성으로 인해 발생합니다.충분한 출력 안정성을 얻기 위해서는, 반도체 레이저가 최고의 전기적 안정성과 최저 수준의 노이즈를 제공하는 다이오드 전류 공급 장치를 통해 정밀한 온도 제어가 가능한 상태에서 작동해야 합니다.실험실의 먼지와 현지 교통 및 건물 장비에서 발생하는 진동을 포함하여 다른 외부 노이즈 소스를 제어해야 합니다.

지속파(cw) 레이저의 빔 강도는 튜브 전류를 전자적으로 제어하거나 광 강도를 조절하는 외부 구성 요소를 사용하여 안정화할 수 있습니다.튜브 구동 전류를 제어하는 데는 종종 2개의 다른 방법이 사용됩니다.정전류 모드에서 튜브 전류는 변동을 최소화하기 위해 전자 피드백 루프에 의해 직접 제어됩니다.레이저 출력은 또한 온도에 따라 달라지기 때문에 충분한 온도 제어가 제공되는 경우 이러한 유형의 제어 회로가 가장 효과적입니다.정출력 전력 안정화 시스템은 빔 스플리터 및 광다이오드 모니터를 사용하여 출력 빔을 샘플링하는 회로에서 유도되는 신호에 대한 응답으로 구동 전류를 제어함으로써 작동합니다.이러한 물리적 배열은 가스 레이저 및 여러 다른 기하학적 구조에 적용할 수 있지만, 소형 다이오드 레이저는 일반적으로 일체형 광다이오드를 이미 포함하는 패키지에 조립됩니다.모니터 광다이오드는 레이저 웨이퍼의 후면에서 방출을 샘플링하고 출력 전력의 피드백 제어를 가능하게 하는 신호를 생성합니다.

레이저 강도를 안정화하는 데 사용되는 외부 구성 요소는 일반적으로 빠른 피드백 시스템을 사용하여 빔 출력의 변동을 최소화하는 전기/광학 변조기를 제어합니다.외부 포켈스(Pockels) 셀 변조기(그림 5 참조)는 여러 제조업체로부터 입수할 수 있으며, 원칙적으로 모든 지속파 레이저의 출력 전력을 안정화하는 데 사용할 수 있습니다.큰 강도 변동(최대 약 50%)은 이 기법으로 보정할 수 있지만, 총 출력 전력은 그에 비례하여 감소합니다.광범위한 보정 기능은 많은 시스템에서 중요합니다.예를 들어, 헬륨-카드뮴 레이저는 부분적으로 특정 빔 주파수 사이의 강한 플라스마 진동으로 인해 출력 전력이 약 20% 정도 변할 수 있습니다.출력 전력의 수백분의 1% 내에서, 그리고 직류 전류에서 수백 메가헤르츠에 이르는 주파수 범위에 걸쳐 cw와 모드 잠금 레이저를 조절하는 데 적합한 것으로 보고되었으며 노이즈 감쇠가 500:1 이상인 시스템이 있습니다.

포켈스 셀 변조기의 기본 구성 요소는 그림 5에 나와 있습니다.그림 5에 나와 있는 설계와 유사한 레이저 출력 강도 조절용 외부 장치는 때때로 노이즈 이터

라는 용어로 분류되거나 시장에서 판매됩니다.포켈스 효과를 사용하는 전기/광학 변조기의 기본 개념은 레이저 강도 제어를 위한 가변 빔 감쇠기를 제공하기 위해 셀의 편광 특성을 매우 빠른 속도로 변화시키는 메커니즘을 기반으로 합니다.레이저 출력의 편광 상태에 따라 변조기의 총 감쇠가 결정되지만, 최대 80%까지 투과가 가능합니다.레이저 헤드에서 방출된 후, 빔의 일부는 빔 스플리터에 의해 광다이오드로 전환되며, 미리 설정된(선택 가능) 기준 강도와 비교하고 차이 신호를 증폭하여 전기/광학 포켈스 셀 변조기를 구동할 수 있게 합니다.증폭된 신호는 셀에서 편광 면을 회전시키는 굴절률 변화를 일으키며, 이를 통해 인가되는 차이 전압에 비례하여 빔 감쇠를 변화시킵니다.전기장의 변화(포켈스 효과)에 따라 편광 특성이 변화하는 물질 중에는 인산이수소 칼륨과 니오브산 리튬이 있으며, 이러한 물질의 결정은 일반적으로 빔 변조기에 사용됩니다.

결론