형광 여기 및 방출의 기초

형광 색소란 특정 파장의 빛 에너지를 흡수하고, 그보다 긴 파장의 빛을 방출하는 광반응성 화합물입니다. 이런 특성 때문에 세포 및 조직 연구에 검출 시약으로 유용합니다. 형광 색소는 특수한 전자 구성 때문에 흡수(통상 여기와 유사) 및 방출에 대한 고유 스펙트럼을 가지고 있습니다. 흡수 및 방출 스펙트럼은 형광의 상대적 강도를 나타내며, 이 상대적 강도는 관행적으로 수직축에, 파장은 수평축에 표시됩니다. 제조업체들은 특정 형광 색소에서 조명 여기 강도 최고치의 파장과 형광 방출 강도 최고치의 파장을 표시합니다. 우선 특정 형광 색소의 여기 및 방출 스펙트럼을 보여주는 그래프와 곡선의 기원을 이해해야 합니다.

형광 색소의 방출 스펙트럼 분석 방법

특정 형광 색소 방출 스펙트럼 측정의 경우 최대 흡수 파장(보통 최대 여기 최대값과 동일)을 측정하고, 형광 색소를 그 파장에서 여기합니다. 일반적인 형광 색소의 흡수 스펙트럼은 그림 1(a)에 표시되며, 이 그림에 측정 파장에 대한 상대적 흡수 강도가 그래프로 표현됩니다. 그 다음, 단색기(광 파장의 좁은 대역을 통과시키는 장치)를 사용해 전체 방출 파장 시리즈에 대한 형광 방출 강도를 스캔합니다. 그림 1(b)와 같이 방출 스펙트럼을 그래프로 그리기 위해, 형광의 상대적 강도를 다양한 파장에서 측정합니다. 마친가지로, 특정 형광 색소의 여기 스펙트럼은 형광원이 연속 파장 그룹을 통해 여기되는 동안 최대 강도의 파장에서 형광 방출을 모니터링해 분석합니다. 최대 방출이 선택되고, 그 파장에서의 방출광만 검출기로 전달됩니다. 여기는 다양한 여기 파장에서 (일반적으로 단색기를 통해) 유도되고, 방출된 형광의 강도는 파장의 함수로 측정됩니다. 그 결과 그래프 또는 곡선이 작성되며(그림 1(a) 참고), 여기 파장 스펙트럼에서 여기에 의해 생성된 상대적 형광 강도를 묘사합니다.

여기 및 방출 스펙트럼의 관찰

대표적인 여기 및 방출 곡선 또는 스펙트럼 조합에서 몇 가지를 관찰할 수 있습니다. 여기 스펙트럼의 높은 파장 말단과 방출 스펙트럼의 낮은 파장 말단은 주로 중첩됩니다. 형광 현미경법에서는 이러한 여기 및 방출 강도 및 파장(그림 1(c))의 중첩을 적절한 여기 필터, 빔 스플리터(반사광 형광) 및 방출 필터를 선택해 제거해야 합니다. 훨씬 더 밝은 여기광이 약한 방출 형광을 압도해 표본의 대비를 현저히 감소시키기 때문입니다.

스토크스의 법칙

전자가 여기 상태에서 바닥 상태로 변하면 진동 에너지가 손실됩니다(이 현상에 대한 정보는 형광의 분자학적 설명 참고).  파장은 복사 에너지()에 반비례하기 때문에 에너지 손실에 의해 방출 스펙트럼은 여기 스펙트럼보다 긴 파장으로 이동합니다. 이 현상을 조지 G. 스토크스 경(Sir George G.)이 19세기 중반에 발견한 스토크스의 법칙 또는 스토크스 이동이라고 합니다. 스토크스 이동이 클수록 여기광과 방출광을 더 쉽게 분리할 수 있습니다. 최대 형광 강도를 달성하기 위해 형광 색소는 최대치 여기 파장에서 최적의 상태로 여기되고, 방출 검출은 방출 곡선의 최대치 파장(또는 관찰자가 선택한 다른 파장)에서 선택됩니다. 여기 파장과 방출 파장은 통과할 수 있는 빛의 파장을 제한하는 해당 필터가 제어해 선택합니다. 전체 광학 시스템의 스펙트럼 응답을 분석할 경우 다양한 파장에 따라 달라지는 유리 투과율 및 검출기 감도와 같은 요소를 고려하기 위한 추가적인 기술적 조정이 필요합니다.

일반적인 형광 색소 흡수-방출 스펙트럼 다이어그램은 그림 2과 같습니다. 흡수의 형광 강도 곡선(보통 순수 화합물의 여기 곡선과 유사)과 이 전형적인 형광 색소의 방출 곡선은 모양이 다소 유사하다는 점에 유의하십시오. 또한 여기 및 방출 곡선은 여기의 상단과 방출 곡선의 더 낮은 파장에서 어느 정도 겹칩니다.

여기 및 방출 파장의 분리

여기 및 방출 파장의 분리는 그림 3처럼 스펙트럼의 특정 파장을 차단하거나 통과시키는 필터를 적절하게 선택해 달성됩니다. 형광 조명기는 표본을 향하는 광 경로(여기)에 쉽게 변경 가능한 필터를 삽입하고 표본에서 방사(방출)하여 여기광과 방출광을 제어하는 방식으로 설계됐습니다. 낮은 방출 강도를 고려할 때 여기를 위해 선택되는 광원은 상대적으로 약한 방출광이 최대화될 수 있도록 충분히 밝아야 하며, 흡수 및 수율이 만족스러운 형광 색소의 선택이 중요합니다.

형광 색소가 여기광을 흡수하는 효율을 분자흡광계수라고 합니다. 분자흡광계수가 클수록 주어진 파장 영역에서 빛을 흡수할 가능성이 커집니다(뒤따르는 형광 방출의 전제 조건).  방출광의 수율을 양자 수율이라고 하며, 이는 흡수된 양자(에너지의 "패킷") 수와 비교한 방출된 양자 수의 비율입니다(많은 상업용 형광 색소의 수율은 0.1에서 0.9 사이임). 1 미만의 양자 수율은 형광의 재복사 경로가 아니라 열 또는 광화학 반응과 같은 비복사 경로를 통한 에너지 손실의 결과입니다. 아래 표 1에 일부 형광 색소 그룹의 형광 양자 수율이 수록됩니다. 일부 양자 수율은 사소해 보이지만(벤젠) 다른 것들은 매우 효율적입니다(플루오레세인 및 로다민-B).

형광 색소의 형광 양자 수율

표 1

분자흡광계수, 양자 수율, 광원의 평균 광도(고유 밝기) 및 형광 수명(여기 상태 지속 시간)은 모두 형광 방출의 강도와 유용성에 중요한 요소입니다. 또한 형광 색소를 둘러싼 국지적 환경은 형광 방출 특성 결정에 있어 가장 중요한 역할을 합니다. 환경 내 용매 점도, 이온 농도, pH 및 소수성과 같은 변수는 형광 강도와 여기 상태의 수명 모두에 중대한 영향을 미칠 수 있습니다.

형광의 분자학적 설명

형광 활성을 나타내는 또 다른 방법은 그림 4(a)처럼 야브론스키 도표를 사용하는 것입니다.여기 이전에 분자의 전자적 구성은 바닥 상태에 있는 것으로 묘사됩니다. 여기광의 광자를 흡수하면 전자는 단 몇 펨토초(10^-15초) 만에 더 높은 에너지 및 진동 여기 상태로 올라갈 수 있습니다.

여기된 전자는 약 1조분의 1초(피코초 또는 10^-12초) 만에 일부 진동 에너지를 주변 환경에 버린 후 최저 여기 단일항 상태로 돌아갈 수 있습니다. 전자는 최저 여기 단일항 상태에서 그림 4(a)와 같이 형광을 동시에 방출하면서 바닥 상태로 다시 "이완"될 수 있습니다. 방출광은 항상 여기광(스토크스 법칙)보다 파장이 길며, 여기 조명이 형광 표본을 비추는 한 계속됩니다. 여기 복사를 멈추면 형광이 중단됩니다.

여기된 전자가 진동 상호작용을 통해 가장 낮은 단일항 상태로 이완되는 대신 여기된 삼중항 상태로 금지 전이를 일으킨 후 복사 방출이 최대 몇 초 이상까지 상당히 지연될 수 있는 과정에서 바닥 상태로 전이되는 경우가 있습니다. 이 현상은 그림 4(b)에 표시된 것과 같은 인광의 특징입니다. 여기된 전자가 삼중항 상태에서 최저 여기 단일항 상태로 되돌아간 후 바닥 상태로 돌아가고, 뒤이어 형광을 방출할 수 있는 경우도 있습니다. 이 과정은 일반적인 형광보다 약간 더 오래(약 1~2마이크로초) 소요되므로 지연 형광이라고 합니다(그림 4(c)). 다른 상황(예: 광퇴색 또는 중금속 염이나 기타 화학 물질의 존재)에서는 방출되는 빛이 크게 감소하거나 완전히 중단될 수 있습니다.

페이딩 또는 광퇴색

여기된 형광원에 의한 빛의 재복사에 영향을 주어 형광의 강도를 감소시킬 수 있는 조건도 있습니다. 이러한 방출 강도의 감소를 일반적으로 페이딩 또는 광퇴색이라고 합니다. 일부 연구자들은 페이딩을 소광 및 퇴색으로 더 세분화합니다. 표백은 산소 분자가 있을 때 빛의 강도 때문에 형광 분자가 비가역적으로 분해되는 것입니다. 소광도 형광 강도의 감소를 초래하며, 산화제 또는 중금속 염이나 할로겐 화합물의 존재로 인해 발생하는 경우가 많이 있습니다.

소광이 여기된 형광원에 물리적으로 가까운 다른 수용체 분자로 에너지가 전달돼 발생하는 경우가 많은데, 이를 공명 에너지 전달이라고 합니다. 이 특별한 현상에 의해 광학 현미경의 측방 분해능보다 훨씬 적은 거리를 측정하는 새로운 기술의 기초가 형성됐습니다.

퇴색 현상은 FRAP 즉, 광퇴색 후 형광 회복이라고 하는 기술로 이어졌습니다. FRAP은 짧은 레이저 버스트를 통한 퇴색을 활용하는 것으로, 이를 이용하면 형광원이 퇴색된 영역으로 확산돼 발생하는 형광 회복을 후속 관찰할 수 있습니다.

많이 사용되는 안티페이드 시약의 특성

표 2

일부 표본의 페이딩 정도를 줄이려면 조명이 여기 필터에 도달하기 전 광 경로에 중립 밀도 필터를 사용해 여기광의 강도를 줄이는 것이 바람직합니다. 장착 매체의 pH를 변경하거나 표백 방지제를 사용해 페이딩 효과를 줄일 수 있는 경우도 있습니다(더 중요한 시약은 표 2에 수록). 디지털 이미징, 현미경 사진술 또는 단순한 시각적 관찰의 경우, 시야를 빠르게 변경해 페이딩 효과를 방지할 수도 있습니다.