현미경 대물렌즈 소개

현미경 대물렌즈는 기본 이미지를 형성하고 현미경이 만들 수 있는 이미지의 품질을 결정하는 데 중요한 역할을 수행하므로 아마도 광학 현미경에서 가장 중요한 구성 요소일 것입니다. 또한 특정 표본의 배율과 현미경에서 미세 표본의 세부 사항을 관찰할 때 적용되는 해상도를 결정할 때도 중요한 역할을 합니다.

대물렌즈는 광학 현미경에서 설계 및 조립이 가장 어려운 구성 요소이며, 빛이 표본에서 이미지 평면으로 진행할 때 가장 먼저 부딪히는 구성 요소이기도 합니다. 대물렌즈(Objective)는 이미지화되는 대상(object)(표본)에서 가장 가까이에 위치한 구성 요소라는 의미에서 이름이 붙여졌습니다.

주요 현미경 제조사들은 광범위한 조명 조건에 따라 탁월한 광학적 특성을 갖추고 기본 광학 수차를 다양하게 보정하는 다양한 대물렌즈 설계를 제공합니다. 그림 1에 제시된 대물렌즈는 250배 긴 작동 거리의 아포크로매트입니다. 이 대물렌즈는 렌즈 더블릿 그룹 3개, 렌즈 트리플릿 그룹 1개 그리고 3개의 개별 내부 단일 요소 렌즈로 접합된 14개의 광학 요소를 포함하고 있습니다. 또한, 대물렌즈에는 반구형 전면 렌즈와 메니스커스 보조 렌즈가 있습니다. 이 렌즈들은 동기식으로 작동하여 최소의 구면수차로 높은 개구수에서 광선을 포착하도록 지원합니다. 이 대물렌즈에는 없지만, 이와 유사한 설계로 된 많은 고배율 대물렌즈에는 손상으로부터 전면 렌즈 요소와 표본을 보호하는 스프링 개폐식 노즈콘 어셈블리가 있습니다. 내부 렌즈 요소는 세심한 조정을 거쳐 대물렌즈 배럴로 캡슐화된 튜브형 황동 하우징에 단단히 삽입됩니다. 개구수, 배율, 광학 튜브 길이, 수차 보정 정도 및 기타 중요한 특성과 같은 특정 대물렌즈 매개변수는 배럴의 외부에 각인됩니다. 그림 1에 제시된 대물렌즈는 이미징 매체로 대물렌즈 전면 렌즈와 표본 사이의 공기를 사용하도록 설계되었지만, 물, 글리세린 또는 특수 탄화수소계 오일을 사용한 이멀젼을 지원하는 전면 렌즈 요소가 있는 대물렌즈도 있습니다.

다양한 내부 유리 렌즈 요소로 구성된 최신 대물렌즈는 높은 수준의 품질과 성능에 도달했으며, 수차 및 필드 평탄도 보정 정도에 따라 대물렌즈의 유용성과 비용이 결정됩니다. 대물렌즈 제조에 사용된 구성 기법과 재료는 지난 100년 동안 크게 향상되었습니다. 오늘날 대물렌즈는 고도의 굴절률을 가진 균일한 구성과 품질의 고급 희소 요소 유리 제형을 사용하여 컴퓨터 보조 설계(CAD)의 도움을 받아 설계됩니다. 이러한 고급 기법을 사용하여 입증된 성능 향상 덕분에 제조사들은 분산이 매우 낮고 코마, 비점수차, 기하학적 왜곡, 필드 곡률, 구면수차 및 색수차 등 대부분의 광학 아티팩트가 보정된 대물렌즈를 생산할 수 있게 되었습니다. 현미경 대물렌즈는 넓은 시야에서 더 많은 수차를 보정할 뿐만 아니라 빛의 투과율이 획기적으로 향상되어 이미지 눈부심이 대폭 감소되어 밝고 선명하고 깨끗한 이미지를 만들어냅니다.

대물렌즈의 세 가지 중요한 설계 특성으로 현미경의 최종 해상도 한계가 설정됩니다. 여기에는 표면에 빛을 비추는 데 사용되는 빛의 파장, 대물렌즈로 포착된 광 원뿔의 개구각 그리고 대물렌즈 전면 렌즈와 표본 사이의 개체 공간의 굴절률이 포함됩니다. 회절 제한 광학 현미경의 해상도는 간격이 가까운 두 개의 표본 지점 사이의 감지 가능한 최소 거리로 설명됩니다.

R = λ / 2n(sin(θ))

여기서 R은 분리 거리, λ는 조명 파장, n은 이미징 매체 굴절률, θ는 대물렌즈 개구각의 절반입니다. 이 공식을 살펴보면, 해상도가 조명 파장에 정비례한다는 점을 분명히 알 수 있습니다. 인간의 눈은 400 및 700나노미터 사이의 파장 구간에 반응합니다. 이 구간은 대부분의 현미경 관찰에 사용되는 가시광 스펙트럼입니다. 또한, 해상도는 이미징 매체 굴절률 및 대물렌즈 각도 조리개에 따라 달라집니다. 대물렌즈는 공기 또는 전면 렌즈 및 표본 간 굴절률이 더 높은 매체를 사용하여 표본을 이미지화하도록 설계되었습니다. 시야는 제한되는 경우가 많으므로 대물렌즈의 전면 렌즈 요소는 광학적 접촉이 필요한 표본 가까이에 배치합니다. 이미징 매체로 공기 대신 이멀젼 오일이 사용되면 대략 1.5의 계수로 해상도가 증가합니다.

마지막으로 가장 중요한 정보는 실제 상한값이 약 72도(사인값 0.95)인 각도 조리개가 대물렌즈 해상도를 결정하는 요인이라는 점일 것입니다. 굴절률과 결합한 산출값은 다음과 같습니다.

n(sin(θ))

이는 개구수(numerical aperture, NA로 축약)로 알려져 있으며, 이 값은 모든 대물렌즈의 해상도를 알려주는 편리한 지표입니다. 개구수는 광학 보정을 제외하고 현미경 대물렌즈를 선택할 때 일반적으로 고려해야 하는 가장 중요한 설계 기준입니다. 개구수 값은 매우 낮은 배율(1배~4배)의 대물렌즈의 경우 0.1부터 특수 이멀젼 오일을 사용하는 고성능 대물렌즈의 1.6까지로 다양합니다. 동일한 배율의 대물렌즈 시리즈에서 개구수 값이 증가되면, 일반적으로 집광 기능이 향상되고 해상도가 증가하는 것을 볼 수 있습니다. 현미경 검사자는 최적의 상황에서 해상된 세부 사항을 편안하게 볼 수 있도록 확대하되 공확대로 인해 미세한 표본의 세부 사항 관찰이 방해받지 않도록 대물렌즈 배율을 신중하게 선택해야 합니다.

현미경 조명의 밝기가 집광기의 작동 개구수 제곱으로 결정되듯이, 대물렌즈로 만들어진 이미지의 밝기도 개구수의 제곱으로 결정됩니다. 또한, 대물렌즈 배율도 이미지 밝기를 결정하는 요소이며 횡방향 배율의 제곱과 반비례합니다. 개구수/배율 비율의 제곱은 투과광과 함께 사용된 경우 대물렌즈의 집광력을 나타냅니다. 대물렌즈의 개구수가 높을수록 수차 보정이 더 잘 되는 경우가 많으므로, 이러한 대물렌즈는 더 많은 빛을 응집하여 더 효과적으로 해상력이 뛰어난 보정된 밝은 이미지를 만들어냅니다. 참고로, 배율이 증가하면 이미지 밝기는 급속도로 감소합니다. 사용 가능한 빛이 제한적일 경우, 개구수가 가장 높고 적절한 해상도를 달성할 수 있는 수준에서 배율이 가장 낮은 대물렌즈를 선택해야 합니다.

대부분의 실험실 현미경에서 일반적으로 사용되는 저가의 대물렌즈는 아크로매트 대물렌즈입니다. 이 대물렌즈는 두 개의 파장(파란색과 빨간색, 약 486 및 656나노미터)으로 된 축 색수차를 보정하여 하나의 공통 초점으로 모읍니다. 또한, 아크로매트 대물렌즈는 녹색의 구면수차가 보정됩니다(546나노미터, 표1 참조). 아크로매트 대물렌즈의 한정적인 보정은 컬러 현미경과 현미경 사진 촬영을 통해 표본을 관찰하고 이미지화할 때 상당한 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 스펙트럼의 녹색 영역에서 초점을 선택하면, 이미지에 붉은 자홍색의 후광(흔히 잔류 색(residual color)이라고 부름)이 발생할 수 있습니다. 아크로매트 대물렌즈를 현미경 사진 촬영에 활용할 경우 녹색 필터(흔히 간섭 필터)를 통과한 빛과 흑백 필름을 사용할 때 최상의 결과를 냅니다. 필드 평탄도(또는 필드 곡률)가 보정되지 않으면 아크로매트 대물렌즈 성능이 저해됩니다. 지난 몇 년간, 대부분의 제조사들은 아크로매트 대물렌즈를 위한 평시야 보정 기능을 제공하기 시작했으며, 이러한 보정된 대물렌즈에 평면 아크로매트(planachromat)라는 이름을 붙였습니다.

그 다음으로 높은 수준의 보정을 제공하고 비용이 드는 대물렌즈는 플로라이트(fluorite) 또는 세미 아포크로매트(semi-apochromat)입니다(그림 2의 중간 대물렌즈). 이렇게 이름이 붙여진 이유는 원래 대물렌드에 사용되었던 광물인 형석(fluorite) 때문입니다. 그림 2는 주요 대물렌즈 종류 3가지를 보여줍니다. 즉, 위에서 설명한 최소 수준의 보정을 제공하는 아크로매트와 추가적인 구면 보정을 제공하는 플로라이트(또는 세미 아포크로매트) 그리고 가장 많이 보정된 대물렌즈인 아포크로매트입니다. 그림 2의 가장 왼쪽에 위치한 대물렌즈는 10배 아크로매트로, 두 개의 내부 렌즈 더블릿과 한 개의 전면 렌즈 요소를 포함하고 있습니다. 그림 2의 중앙에는 반구형 전면 렌즈와 보조 메니스커스 렌즈와 더불어 두 개의 더블릿 및 한 개의 트리플릿이 포함된 여러 렌즈 그룹이 있는 10배 플로라이트 대물렌즈가 있습니다. 그림 2의 오른쪽에 있는 10배 아포크로매트 대물렌즈 역시 여러 렌즈 그룹과 단일 요소들을 포함하고 있습니다. 이 대물렌즈는 플로라이트 대물렌즈와 구성이 유사하지만, 곡률과 두께가 다르고 아포크로매트 대물렌즈에 고유한 구성으로 배열되어 있습니다.

대물렌즈의 광학 수차 보정

표 1

대물렌즈 조립 과정에서 먼저 렌즈를 전략적인 간격으로 셀 마운트에 장착한 다음 대물렌즈 배럴 내부에 장착된 중앙 슬리브 실린더로 포장합니다. 렌즈가 정밀한 레이드 척에서 회전하는 상태에서 개별 렌즈를 청동 숄더 마운트에 장착한 다음, 렌즈(또는 렌즈 그룹)를 제자리에 고정하는 금속의 얇은 가장자리로 광을 냅니다. 구면수차는 하단의 두 렌즈 마운트(반구형 및 메니스커스 렌즈) 사이에 들어맞는 최적의 스페이서 세트를 선택하여 보정합니다. 초점을 잃지 않고 여러 노즈피스에 장착된 대물렌즈들을　교대로 사용할 수 있도록 고정 너트를 사용하여 슬리브 안에서 전체 렌즈 클러스터를 위쪽 또는 아래쪽으로 변환함으로써 대물렌즈를 파포컬　상태로 만듭니다. 대물렌즈의 광학 축에　대해서는 내부 렌즈 그룹의 위치를 최적화할 수 있는 세 개의 중심 조정 나사로　코마를 조정합니다.

플로라이트 대물렌즈는 형석 또는 신생 합성 대체물 등의 재료를 포함한 고급 유리 제형으로 만듭니다. 이러한 새로운 재료의　사용으로 광학 수차 보정을 대폭 향상할 수 있습니다. 아크로매트와 비슷하게, 플로라이트 대물렌즈도 빨간색 및 파란색 빛의 수차를 보정합니다. 또한 아크로매트와 마찬가지로 플로라이트 역시 단일 색상 대신 두세 색상의 구면수차를 보정합니다. 아크로매트와 비교할 때 플로라이트 대물렌즈의 뛰어난 보정 기능 덕분에 개구수가 높은 대물렌즈 제작이 가능하므로 더 밝은 이미지를 얻을 수 있습니다. 플로라이트 대물렌즈는 아크로매트보다 뛰어난 해상력과 대비 수준을 제공하므로 아크로매트보다 백색광 기반 컬러 현미경 사진 촬영에 더 적합합니다.

가장 높은 수준의 보정(그리고 비용)을 제공하는 것은 그림 2와 3에서 볼 수 있는 아포크로매트 대물렌즈입니다. 아포크로매트는 현재 사용 가능한 것 중 가장 많이 보정되는 현미경 렌즈이며, 아포크로매트의 높은 가격은 정교한 설계와 제조 시 요구되는 세심한 조립 작업을 반영합니다. 그림 3에서는 배율 범위가 10배~100배인 아포크로매트 대물렌즈 시리즈의 렌즈 요소를 비교했습니다. 저성능 아포크로매트 대물렌즈(10배 및 20배)는 고성능(40배 및 100배) 아포크로매트 대물렌즈보다 작동 거리가 길고 전반적인 대물렌즈 길이가 짧습니다. 전통적으로 아포크로매트는 3가지 색상(빨간색, 녹색 및 파란색)의 색수차를 보정하여 색수차를 거의 제거하며, 두 개 또는 세 개의 파장에 대해 구면수차를 보정합니다(표1 참조). 아포크로매트 대물렌즈는 백색광 기반 컬러 현미경 사진 촬영에 최적의 선택입니다. 높은 수준의 보정을 수행하므로 특정 배율에서 아포크로매트 대물렌즈는 아크로매트 또는 플로라이트 대물렌즈보다 개구수가 높습니다. 다수의 신형 고성능 플로라이트 및 아포크로매트 대물렌즈는 4가지(짙은 파란색, 파란색, 녹색, 빨간색) 이상의 색상에 대해 색수차를 보정하고 4가지 색상에 대해 구면수차를 보정합니다.

이 세 가지 대물렌즈 모두 두드러진 필드 곡률이 단점이며, 평탄하지 않고 다소 곡선인 이미지를 투사합니다. 이러한 아티팩트는 배율이 높을수록 심해집니다. 곡선의 렌즈 표면으로 인한 이러한 내재적 문제를 극복하기 위해 광학 설계자는 평시야 보정 대물렌즈를 만들었습니다. 이 대물렌즈는 시야 전반에서 공통 초점을 유지하는 이미지를 만들어냅니다. 평시야 보정 및 적은 왜곡을 제공하는 대물렌즈를 잔여 수차의 정도에 따라 평면 아크로매트, 평면 플로라이트 또는 평면 아포크로매트라고 부릅니다. 이러한 보정 기능은 가격을 상승시키지만 디지털 이미징과 일반적인 현미경 사진 촬영에서 상당히 가치가 있는 기능입니다.

보정되지 않은 필드 곡률은 플로라이트(세미 아포크로매트) 및 아포크로매트 대물렌즈에서 발생하는 가장 심각한 광학 수차이며, 수년 동안 피할 수 없는 아티팩트로 여겨져 왔습니다. 일반적으로 사용할 때 표본의 모든 세부 사항을 포착하기 위해 시야의 중심과 가장자리 사이에서 초첨을 계속 다시 맞춰야 합니다. 평시야(평면) 보정이 대물렌즈에 도입되면서 완벽한 현미경 사진 촬영과 비디오 현미경 검사를 수행할 수 있게 되었으며 오늘날 범용 대물렌즈와 고성능 대물렌즈 모두에서 기본적으로 제공됩니다. 필드 곡률 보정은 그림　４에서와　같이　대물렌즈에 상당히 많은 렌즈 요소를 추가한　단순　아크로매트를　사용합니다. 그림 4의 왼쪽에 있는 보정되지 않은 아크로매트는 단순한 얇은 렌즈 전면 요소 외에도 두 개의 렌즈 더블릿을 포함합니다. 이와 대조적으로, 그림 4의 오른쪽에 있는 보정된 평면 아크로매트는 세 개의 렌즈 더블릿, 하나의 중앙 렌즈 트리플릿 그룹 그리고 반구형 전면 렌즈 뒤에 위치한 하나의 메니스커스 렌즈를 포함합니다. 이 예에서는 평면 보정을　위해 6개의 렌즈 요소를　추가하여　정교한　렌즈　그룹을　만들었습니다 　이는 대물렌즈의 광학적 복잡성을　크게　증가시킵니다. 플로라이트 및 아포크로매트 대물렌즈의 경우에도 평면 보정을 위해 렌즈의 수가 상당히 증가하며, 이로 인해 내부 대물렌즈 슬리브 안에 렌즈가 매우 빽빽하게 배치되는 경우가 많습니다(그림 1 참조). 일반적으로, 필드 곡률이 보정된 평면 대물렌즈는 여유 작동 거리를 상당히 많이 포기해야 하며, 고배율 버전 중에는 오목한 전면 렌즈가 많아 청소와 유지보수가 매우 어렵습니다.

구형 대물렌즈는 일반적으로 개구수가 낮으며, 배율 색수차라는 수차가 발생합니다. 배율 색수차는 보정 대안렌즈 또는 접안렌즈를 사용한 보정이 필요합니다. 이러한 유형의 보정은 고정 튜브 길이 현미경 시대에 흔했지만, 최신 무한 보정 대물렌즈와 현미경에서는 불필요합니다. 최근 몇 년 동안 최신 현미경 대물렌즈는 대물렌즈 자체(Olympus 및 Nikon) 에서 배율 색수차 보정 기능이 내장되거나 튜브 렌즈에서 보정됩니다(Leica 및 Zeiss).

무한 보정 시스템의 중간 이미지는 광학 경로의 튜브 렌즈 뒤의 기준 초점 길이(이전에는 광학 튜브 길이라고 부름)에서 나타납니다. 이 길이는 제조사의 설계 제약에 따라 160~250밀리미터입니다. 무한 보정 대물렌즈의 배율은 기준 초점 길이를 대물렌즈의 초점 길이로 나누어 계산합니다.

대부분의 생물학 및 암석분류학 분야에서는 표본의 무결성을 보호하고 관찰을 위한 선명한 창을 제공하기 위해 표본을 장착할 때 커버 글라스를 사용합니다. 커버 글라스는 표본의 각 지점에서 시작되는 광 원뿔을 수렴시킬 뿐만 아니라 대물렌즈로 보정해야 하는 색수차 및 구면수차(그리고 그로 인한 대비 손실)를 유발합니다. 광선의 수렴 정도는 커버 글라스의 굴절률, 분산, 두께에 따라 결정됩니다. 커버 글라스 배치 내에서 굴절률은 상대적으로 일정하지만 두께는 0.13에서 0.22밀리미터로 다양합니다. 또 다른 우려 사항은 습식 대상 또는 두껍게 장착된 전처리 표본과 커버 글라스 사이에 있는 수성 용제 또는 과도한 장착 매체입니다. 예를 들면, 굴절률이 커버슬립의 굴절률과 상당히 다른 생리 식염수를 사용할 경우 대물렌즈는 몇 미크론밖에 되지 않는 수성 층을 통해 초점을 맞추어야 합니다. 따라서 상당한 수차와 초점면 위아래에서 더 이상 대칭적이지 않은 점 확산 함수의 편차를 유발합니다. 이러한 요인은 커버슬립의 굴절률과 두께에 사실상의 변화를 초래하며, 현미경 검사자가 통제하기가 매우 어렵습니다.

대물렌즈의 렌즈 요소 설계에서 구면수차 및 코마를 보정하는 데에는 대물렌즈 전면 렌즈와 표본 커버슬립 사이의 이미징 매체 또한 매우 중요한 역할을 합니다. 저성능 대물렌즈는 상대적으로 개구수가 낮으며, 대물렌즈 전면 렌즈와 커버 글라스 사이의 이미징 매체로 공기만 사용할 수 있는 건식으로 설계되었습니다. 공기로 달성 가능한 이론적인 최대 개구수는 1.0이지만, 현실에서는 개구수가 0.95를 넘는 건식 대물렌즈를 만드는 일은 거의 불가능합니다. 커버 글라스 두께의 변화로 인한 영향은 개구수가 0.4 미만이 건식 대물렌즈의 경우 무시할 만한 수준이지만, 개구수가 0.65를 넘는 경우 두께의 변화는 중요한 영향을 미치며, 0.01밀리미터의 변화도 구면수차를 유발할 수 있습니다. 이는 공기 중에서 매우 짧은 작동 거리를 사용해야 하고 선명한 이미지 획득을 어렵게 만드는 구면수차에 대한 민감한 보정 기능을 포함하는 고성능 아포크로매트에 문제가 됩니다.

이 문제를 해결하기 위해 많은 고성능 아포크로매트 건식 대물렌즈에는 커버 글라스 두께의 변화를 보정하여 구면수차를 보정하도록 조정하는 보정환이 있습니다(그림 5 참조). 이 보정환을 회전하여 구면수차를 광학적으로 보정할 수 있습니다. 보정환을 회전하면 대물렌즈의 렌즈 요소 그룹 두 개가 더 가까워지거나 멀어지게 조정할 수 있습니다. 그림 5의 왼쪽에 있는 대물렌즈는 조정 가능한 렌즈 요소들을 가깝게 조정하여 0.20mm의 커버 글라스에 맞게 보정환을 조정한 것입니다. 이와 대조적으로, 그림 5의 오른쪽에 있는 대물렌즈는 매우 두꺼운 커버 글라스(0.13mm)를 보정하기 위해 조정 가능한 렌즈 요소를 다소 긴 거리만큼 떨어뜨려 놓은 것입니다. 정립 투과광 현미경을 위해 설계된 대부분의 보정환 대물렌즈는 0.10에서 0.23밀리미터 사이의 커버 글라스 두께 변화를 지원하는 조정 범위를 갖습니다. 도립 현미경으로 조직 배양 표본을 관찰하기 위해 설계된 많은 특수 위상차 대물렌즈는 보상 범위가 0~2밀리미터로 훨씬 더 넓습니다. 이 덕분에 크기 범위에서 두께 변화가 큰 경우가 많은 대부분의 배양 용기 바닥을 통해 표본을 관찰할 수 있습니다. 혈액 도말 표본과 같이 덮히지 않은 표본 역시 커버 글라스가 없는 상태를 반영하기 위해 보정환을 0으로 조정하여 보정환 대물렌즈로 관찰할 수 있습니다.

보정환이 없는 높은 개구수의 건식 대물렌즈는 흔히 커버 글라스 두께가 별로 중요하지 않은 낮은 개구수의 대물렌즈로 촬영한 이미지보다 품질이 떨어지는 이미지를 만들어냅니다. 이러한 이유로, 커버 글라스 변화로 인해 동반되는 아티팩트 없이 더 우수한 대비를 얻기 위해서는 일반적으로 낮은 배율(및 개구수)의 대물렌즈를 선택하는 것이 현명합니다. 예를 들면, 고배율 대물렌즈의 해상력이 이론적으로 더 우수할지라도 개구수가 0.65인 40배 대물렌즈는 개구수가 0.85인 60배 대물렌즈보다 더 우수한 대비의 선명한 이미지를 만들게 될 수 있습니다.

커버 글라스의 표준 두께는 0.17밀리미터입니다. 이 두께는 1½이라는 숫자를 사용한 커버 글라스로 지정되어 있습니다. 안타깝게도, 모든 1½ 커버 글라스가 이처럼 가까운 공차(0.16~0.19밀리미터)로 제조되지는 않으며, 많은 표본이 표본과 커버 글라스 사이에 매체를 사용합니다. 커버 글라스 두께 보정은 현미경의 기계적 튜브 길이를 조정하거나 (앞서 설명했듯이) 대물렌즈 배럴 안의 중요한 요소들 간의 간격을 조정하는 특수 보정환을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이와 같이 보정환은 대물렌즈 성능을 최적화하기 위해 미세한 차이를 보정하는 데 사용됩니다. 보정환이 있는 대물렌즈를 제대로 사용하려면 현미경 검사자가 적절한 이미지 기준에 따라 보정환을 재설정할 수 있을 만큼 숙련되어야 하며, 주의를 기울여야 합니다. 대부분의 경우 보정환을 조정하는 동안 초점이 이동하여 이미지의 위치가 이동할 수 있습니다. 표본 이미지의 변화를 관찰하면서 대물렌즈 보정환을 조금씩 조정하려면 아래에 나열된 단계를 따르십시오.

• 대물렌즈 배럴의 표시기 마크가 보정환 하우징에 새겨진 0.17밀리미터 눈금 마크와 일치하도록 보정환을 위치시킵니다.
• 표본을 스테이지에 올려놓고 작은 표본 특성에 현미경의 초점을 맞춥니다.
• 보정환을 아주 약간 돌려 대물렌즈의 초점을 다시 맞추고 이미지가 개선되었는지 또는 저하되었는지 확인합니다. 대부분의 준비된 표본이 너무 두꺼운 커버 글라스/매체 사이에 끼어 있기 때문에 지장을 받으므로 먼저 큰 보정 값(0.18~0.23)으로 보정환을 회전합니다.
• 한 방향으로 보정환을 회전하면서 이전 단계를 반복하여 이미지가 향상되는지 또는 저하되는지 확인합니다.
• 이미지가 저하되면 같은 단계에 따라 보정환을 반대 방향으로 (더 낮은 값을 향해) 회전하여 최적의 해상도와 대비를 제공하는 위치를 찾습니다.

오일, 글리세린 또는 물과 같은 이멀젼 매체와 함께 대물렌즈를 사용하도록 설계하면 대물렌즈의 개구수를 대폭 증가시킬 수 있습니다. 유리 커버슬립과 유사한 굴절률의 이멀젼 매체를 사용하면 커버 글라스의 두께 변화로 인한 이미지 저하를 사실상 방지할 수 있습니다. 이를 통해 넓은 경사의 광선이 더 이상 굴절되지 않고 대물렌즈에 의해 더 잘 포착될 수 있습니다. 일반적인 이멀젼 오일은 굴절률이 1.51이며 분산이 유리 커버슬립과 유사합니다. 표본을 통과하는 광선은 커버슬립과 이멀젼 오일 사이의 동질적 매체를 만나게 되며, 렌즈에 들어갈 때 굴절되지 않지만 상부 표면을 나올 때에만 굴절됩니다. 따라서 표본이 (초점 및 필드 중앙에서) 첫 번째 대물렌즈의 무수차 지점에 배치되면, 렌즈 시스템의 이 부분을 사용한 이미징은 완전히 구면수차 없이 수행됩니다.

실용적인 오일 이멀젼 대물렌즈의 일반적 설계에는 반구형 전면 렌즈 요소와 요철 메니스커스 렌즈 및 더블릿 렌즈 그룹이 포함됩니다. 그림 6에는 일반적인 아포크로매트 오일 이멀젼 대물렌즈의 첫 두 렌즈 요소에서 발생하는 무수차 굴절을 보여줍니다. 표본은 반구형 렌즈 요소의 무수차 지점인 P 지점에서 현미경 슬라이드와 커버 글라스 사이에 끼어 있습니다. 반구형 렌즈 후면에서 굴절된 광선은 P(1) 지점으로부터 진행되는 것처럼 보입니다. P(1) 지점은 메니스커스 렌즈의 첫 번째 표면의 곡률 중심이기도 합니다. 굴절된 광선은 첫 번째 표면의 반경을 따라 메니스커스 렌즈로 들어가며 이 표면에서 굴절이 발생하지 않습니다. 메니스커스 렌즈의 후면 표면에서 광선이 무수차로 굴절되므로 P(2) 지점에서 분기되는 것처럼 보입니다. 대물렌즈의 후속 렌즈 그룹의 표면에서 일어나는 광선의 굴절은 P 지점에서 시작되는 광선의 수렴을 완성하여 중간 이미지를 형성합니다.

또한 적절하게 설계된 오일 이멀젼 대물렌즈는 최소의 구면수차를 유발하면서 첫 두 렌즈 요소로 인해 발생하는 색수차 결함을 보정합니다. 첫 렌즈 요소에 들어가기 전에 광 원뿔이 부분적으로 수렴되는 현상 덕분에 구면수차가 통제됩니다. 커버슬립과 첫 번째 렌즈 요소 사이에 오일 매체를 사용하지 않고 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하면 결함이 있는 이미지가 형성된다는 점에 유의하십시오. 이는 전면 렌즈 표면에서 발생하는 굴절 때문이며 다음 렌즈 구성 요소로 보정할 수 없는 구면수차를 유발합니다.

잘못된 이멀젼 액체를 사용하면 오일 이멀젼 대물렌즈의 장점이 심각하게 저해됩니다. 현미경 제조사들은 굴절률 및 분산에 대한 매우 적은 공차를 가진 대물렌즈를 생산합니다. 이러한 대물렌즈에는 커버 글라스와 대물렌즈 전면 렌즈 사이에 들어가는 액체에 일치하는 값이 필요합니다. 결정화 또는 상분리와 같은 불량한 아티팩트를 방지하기 위해 여러 제조사의 이멀젼 오일을 섞어서 사용하지 않고 대물렌즈 제조사가 권장하는 오일만 사용해야 합니다.

생리 식염수 용액에 적신 조직 배양물 또는 절편의 생세포에 사용 가능한 이미징 매체로 물 및/또는 글리세린을 사용하는 대물렌즈도 있습니다. 평면 아포크로매트 워터 이멀젼 렌즈는 보정환이 장착되어 있고, 개구수가 최대 1.2입니다. 이 개구수는 오일 이멀젼 렌즈보다 약간 더 적은 값입니다. 이러한 대물렌즈를 사용하면 현미경 검사자는 최대 200미크론의 수성 매체를 통해 초점을 맞추고 탁월한 광학 보정을 유지할 수 있습니다. 단점은 개구수가 높은 워터 이멀젼 렌즈는 수천 달러의 비용이 드는 경우가 많으며, 굴절력이 있는 조직 또는 세포 부분에 깊숙이 대물렌즈의 초점을 맞출 경우 이미지가 여전히 저하될 수 있다는 점입니다. 워터, 글리세린, 오일 이멀젼 대물렌즈에 대한 자세한 내용은 현미경 입문서의 이멀젼 매체 섹션에서 확인할 수 있습니다.

대물렌즈 사양 및 식별에 대한 섹션에서 설명했듯이 대물렌즈 배럴에는 많은 정보가 새겨져 있습니다. 간단히 말하자면, 각 대물렌즈에는 배율(예: 10x, 20x 또는 40x 등), 대물렌즈가 최상의 이미지를 생성하도록 설계된 튜브 길이(일반적으로 160밀리미터 또는 그리스 무한대 기호), 그리고 구면수차를 보정할 때 설계자가 일정한 값을 갖는다고 가정한 커버 글라스의 두께(일반적으로 0.17밀리미터)가 새겨져 있습니다. 대물렌즈와 표본 사이에 오일을 한 방울 떨어뜨려 사용해야 하는 경우, 대물렌즈에는 OIL 또는 OEL 또는 HI(Homogeneous Immersion, 균질 이멀젼)라고 새겨져 있습니다. 이러한 문자가 대물렌즈에 새겨져 있지 않으면, 대물렌즈의 가장 낮은 부분과 표본 사이에 공기가 들어가는 건식 대물렌즈로 사용해야 합니다. 또한 대물렌즈에는 항상 개구수(NA) 값이 새겨져 있습니다. 개구수는 저성능 대물렌즈의 경우 0.04부터 고성능 오일 이멀젼 아포크로매트 대물렌즈의 경우 1.3 또는 1.4까지 다양합니다. 대물렌즈에 높은 보정에 대한 정보가 없으면, 아크로매트 대물렌즈라고 간주할 수 있습니다. 더 고도로 보정된 대물렌즈에는 apochromat 또는 apo, plan, FL, fluor 등이 새겨져 있습니다. 구형 대물렌즈는 배럴에 배율의 척도인 초점 길이(렌즈-이미지 거리)가 새겨져 있는 경우가 많습니다. 최신 현미경의 대물렌즈는 특정 광학 튜브 길이에 맞게 설계되므로 초점 길이와 배율을 모두 배럴에 새기는 것은 다소 중복된 정보를 전달하는 것입니다.

표 2에는 가장 일반적인 대물렌즈 종류 4가지인 아크로매트, 평면 아크로매트, 평면 플로라이트 및 평면 아포크로매트에 대한 배율 함수로서 작동 거리와 개구수가 나열되어 있습니다. 참고로, 건식 대물렌즈는 모두 개구수 값이 1.0 미만이며, 액체 이멀젼 매체용으로 설계된 대물렌즈만 개구수가 1.0을 초과합니다.

배율별 대물렌즈 사양

표 2

제조사의 매칭된 대물렌즈 세트, 예를 들면 다양한 배율의 모든 아크로매트 대물렌즈(표2에 나열된 대물렌즈의 단일 하위 그룹)가 노즈피스에 장착될 경우, 이러한 대물렌즈는 일반적으로 본체 튜브에서 거의 동일한 평면에 이미지를 투사합니다. 따라서 노즈피스를 회전하여 대물렌즈를 바꾸려면 날카로운 초점을 다시 맞추기 위해 미세한 조절 손잡이를 최소한으로만 사용하면 됩니다. 이러한 대물렌즈 세트를 동초점이라고 묘사하며, 이는 유용하고 편리한 안전 기능입니다. 대물렌즈의 매칭된 세트는 또한 한 대물렌즈의 시야 중심에 위치한 표본이 다른 대물렌즈를 사용하기 위해 노즈피스를 회전해도 중심에 계속 남아 있도록 동중심(parcentric)으로 설계되었습니다.

수년간, 대부분의 제조사가 생물학용으로 설계한 대물렌즈는 모두 국제 동초점 거리 표준을 따랐습니다. 그러므로, 대부분의 대물렌즈는 동초점 거리가 45.0밀리미터였으며, 상호 교체가 가능한 것으로 여겨졌습니다. 무한 보정 튜브 길이로 이동하면서, 대물렌즈 및 튜브 렌즈의 수차를 보정하기 위한 새로운 설계 기준이 등장했습니다. 이와 함께 훨씬 더 긴 작동 거리와 더 높은 개구수 및 필드 크기에 대한 요구를 충족하기 위한 유연성 향상에 대한 수요가 증가하면서 이처럼 여러 제조사의 대물렌즈를 상호 교체하여 사용할 수 없게 되었습니다. 이러한 변화를 보여주는 예로는 “Chrome Free” 대물렌즈, 튜브 렌즈 및 접안렌즈를 사용하는 최신 Nikon CFI-60 광학 시스템이 있습니다. CFI-60 시스템의 각 구성 요소는 서로를 보정하지 않고 별개로 보정됩니다. 튜브 렌즈를 사용하여 튜브 길이는 무한대(평행 광선 경로)로 설정되며, 동초점 거리는 60밀리미터로 증가되었습니다. 심지어 대물렌즈의 장착 나사산 크기도 광학 시스템의 새로운 요구 사항을 충족하기 위해 20.32밀리미터에서 25밀리미터로 변경되었습니다.

광학 현미경의 필드 직경은 시야수(field-of-view number 또는 간단히 field number로 지칭)로 표현됩니다. 시야수는 시야의 직경을 밀리미터 단위로 표현한 것이며, 중간 이미지 평면에서 측정됩니다. 대상(표본)의 필드 직경은 시야수를 대물렌즈의 배율로 나눈 것이 됩니다. 시야수는 대안렌즈(접안렌즈) 필드 다이어프램의 배율 및 직경 때문에 제한되는 경우가 많지만, 대물렌즈의 설계로 인한 제한도 분명히 존재합니다. 초기 현미경 대물렌즈의 경우 최대 가용 필드 직경이 약 18밀리미터(또는 고배율 접안렌즈를 사용할 경우 훨씬 더 적은 직경)로 제한되었지만, 최신 평면 아포크로매트 및 기타 특수 평시야 대물렌즈는 가용 필드의 범위가 22~28밀리미터이거나 광시야 접안렌즈와 결합된 경우 그 이상인 경우가 많습니다. 안타깝게도, 최대 가용 시야수는 대물렌즈 배럴에 일반적으로 새겨져 있지 않으며 현미경 카탈로그에도 표시되지 않습니다.

이미지 선명도를 주목할 정도로 변화시키지 않고 대물렌즈 초점을 맞출 수 있게 하는 축 범위는 대물렌즈의 피사계 심도라고 부릅니다. 이 값은 대물렌즈의 개구수가 낮은 값에서 높은 값이 될수록 크게 변하며, 일반적으로 개구수가 커지면 감소합니다(표 3 및 그림 7 참조). 높은 개구수에서 피사계 심도는 주로 파동광학에 의해 결정되지만, 낮은 개구수에서는 기하학적 광학 “허용착란원(circle of confusion)”이 지배합니다. 총 피사계 심도는 다음과 같은 공식에 따라 파동광학 및 기하학적 광학 피사계 심도의 합계로 결정됩니다.

dtot = λn/NA2 + (n/M•NA)e

여기서 λ는 빛의 파장이고, n은 이미징 매체의 굴절률이며, NA는 대물렌즈의 개구수이고, M은 대물렌즈의 횡방향 배율이고, e는 대물렌즈의 이미지 평면에 배치된 감지기가 해상할 수 있는 최소 거리입니다. 참고로, 회절 제한 피사계 심도(공식 오른쪽에 있는 첫 번째 항목)는 개구수의 제곱과 반비례하여 줄어들며, 횡방향 해상 한계는 개구수의 1승으로 줄어듭니다. 그 결과, 광학 절편의 축 해상도와 두께는 현미경의 횡방향 해상도보다 시스템의 개구수로부터 훨씬 더 많이 영향을 받습니다(표 3 참조).

피사계 심도와 이미지 깊이

표 3

커버 글라스의 가장 가까운 표면과 대물렌즈 전면 렌즈 사이의 공간 거리를 작동 거리라고 부릅니다. 커버 글라스 없이 표본의 이미지화를 수행하는 경우, 작동 거리는 표본의 실제 표면에서 측정합니다. 일반적으로, 작동 거리는 배율과 개구수가 증가함에 따라 매칭된 대물렌즈 시리즈에서 감소합니다(표 2 참조). 공기를 이미징 매체로 사용하여 표본을 관찰하도록 설계된 대물렌즈는 개구수 요구 사항이 충족될 경우 최대한 긴 작동 거리를 가질 수 있습니다. 반면, 이멀젼 대물렌즈는 전면 렌즈와 표본 사이에 이멀젼 액체를 포함할 수 있도록 작동 거리가 더 얕아야 합니다. 가까운 작동 거리로 설계된 대물렌즈에는 스프링이 장착된 개폐형 스토퍼가 있는 경우가 많습니다. 이 스토퍼를 대물렌즈 안으로 누르면 전면 렌즈 어셈블리가 후퇴하고, 이 스토퍼를 비틀면 제자리에 고정됩니다. 이러한 액세서리는 접안렌즈에서 대물렌즈를 회전할 때 깨끗한 슬라이드 표면에 이멀젼 오일이 묻지 않도록 방지할 수 있어 편리합니다. 개폐형 스토퍼를 반대 방향으로 비틀면 렌즈 어셈블리가 해제되어 사용 가능한 상태가 됩니다. 일부 응용 분야(아래 참조)에서는 긴 여유 작동 거리가 반드시 필요하기 때문에 큰 개구수와 필요한 정도의 광학 보정을 달성하는 것이 어려움에도 불구하고 이러한 용도로 특수 대물렌즈가 설계됩니다.

최근 몇 년간 가장 중요한 대물렌즈 설계 개선 사항 중 하나는 반사 방지 코팅 기술의 발전입니다. 이 기술의 발전으로 빛이 렌즈 시스템을 통과할 때 발생하는 원치 않는 반사를 줄일 수 있습니다. 코팅되지 않은 각 공기-유리 접면은 표면에 직각인 입사광의 4~5%를 반사하므로 직각 입사 시 투과율 값이 95~96%가 됩니다. 적절한 굴절률로 1/4 파장 두께의 반사 방지 코팅을 적용하면 이 값을 3~4%만큼 감소시킬 수 있습니다. 렌즈 요소의 수의 지속적인 증가로 대물렌즈가 더욱 정교해짐에 따라, 내부 반사를 방지해야 하는 필요성도 커지고 있습니다. 높은 수준의 보정 기능을 갖춘 최신 대물렌즈의 경우, 렌즈 요소를 15개까지 포함할 수 있어 공기-유리 접면이 많아질 수 있습니다. 렌즈를 코팅하지 않으면, 축 광선 자체의 반사 손실로 인해 투과율 값이 약 50%로 떨어집니다. 눈부심을 감소시키고 투과율을 향상하기 위해 사용되었던 단층 렌즈 코팅은 가시광 스펙트럼 범위에서 99.9%를 초과하는 투과율 값을 달성하는 다층 코팅으로 대체되었습니다.

그림 8은 두 개의 반사 방지 층으로 코팅된 렌즈 요소를 통해 반사 및/또는 통과되는 빛의 파장을 보여주는 개략도입니다. 입사 파장이 첫 번째 층에 특정 각도로 부딪혀(그림 3의 층 A) 빛의 일부는 반사되고(R(o)) 일부는 첫 번째 층을 투과합니다. 두 번째 반사 방지 층(층 B)에 도달할 때, 빛은 또 다른 일부가 동일한 각도로 반사되어 첫 번째 층에서 반사된 빛을 방해합니다. 남은 빛의 파장의 일부는 계속 진행하여 유리표면에 도달하며, 여기서 또 다시 반사되고 투과됩니다. 유리 표면에서 반사된 빛은 (건설적으로 그리고 파괴적으로) 반사 방지 층에서 반사된 빛을 방해합니다. 반사 층의 굴절률은 유리의 굴절률과 주변 매체(공기)의 굴절률 사이입니다. 빛의 파장이 반사 방지 층을 통과하면서 (입사각(일반적으로 광학 현미경에서는 직각임)에 따라 다름) 대부분의 빛은 궁극적으로 유리를 투과하고 초점이 맞춰져 이미지를 형성합니다.

얇은 층의 광학 반사 방지 코팅에 사용되는 많은 물질 중 하나는 불화 마그네슘이지만, 현재는 대부분의 현미경 제조사들이 자체적으로 독자적인 제제를 생산합니다. 그 결과 일반적으로 투과 대역 밖에서 고조파 관련 주파수에 동시에 파괴 간섭이 발생하면서 가시광 파장의 대비와 투과가 대폭 개선됩니다. 이러한 특수 코팅은 부적절하게 취급할 경우 쉽게 손상되므로 현미경 검사자는 그 취약성을 염두에 두어야 합니다. 다층 반사 방지 코팅은 약간 녹색인 반면 단층 코팅은 약간 자주색을 띠므로 색조를 관찰하여 코팅의 종류를 구분할 수 있습니다. 내부 렌즈에 사용된 반사 방지 코팅의 표면층은 일반적으로 외부 렌즈 표면을 보호하기 위한 반사 방지 코팅보다 훨씬 더 부드럽습니다. 얇은 필름으로 코팅된 광학 표면을 청소할 때는 각별히 주의해야 합니다. 특히 현미경을 분해하여 내부 렌즈 요소가 드러난 경우에는 더욱 그러합니다.

렌즈 시스템의 초점 길이는 렌즈 중심에서 평행 광선이 광학 축에서 초점이 맞는 지점(흔히 주초점이라고 부름)까지의 거리로 정의됩니다. 주초점에 직각인 가상의 면을 렌즈 시스템의 초점면이라고 부릅니다. 모든 렌즈는 각 면으로 들어오는 빛을 위한 두 개의 주초점이 있습니다. 즉, 전면의 주초점과 후면의 주초점이 있습니다. 통상적으로, 전면 렌즈 요소와 더 가까운 대물렌즈 초점면을 전면 초점면이라고 부르고 대물렌즈 뒤에 위치한 초점면을 후면 초점면이라고 부릅니다. 후면 초점면의 실제 위치는 대물렌즈의 구성에 따라 다르지만, 일반적으로 후면 초점면은 고배율 대물렌즈의 경우 대물렌즈 배럴 안쪽에 위치해 있습니다. 저배율 대물렌즈는 흔히 후면 초점면이 배럴 밖 즉, 나사산 영역 또는 현미경 접안렌즈 안에 있습니다.

광선이 대물렌즈를 통과할 때 대물렌즈의 후면 조리개 또는 사출 동공 때문에 제약을 받습니다. 이러한 조리개의 직경은 저배율 대물렌즈의 경우 12밀리미터부터 가장 성능이 뛰어난 아포크로매트 대물렌즈의 경우 약 5밀리미터까지 다양합니다. 대물렌즈가 이미징 시스템이자 집광기로서 역할을 해야 하고 출사 동공이 곧 입사 동공인 에피 조명을 사용하는 경우 조리개 크기가 매우 중요해집니다. 시야 전반에 고른 조명을 제공하려면 광원의 이미지가 대물렌즈의 후면 조리개를 완전히 채워야 합니다. 광원 이미지가 조리개보다 작으면 불균일한 조명으로 인해 시야에서 비네팅이 발생합니다. 반면, 광원 이미지가 후면 조리개보다 크면 일부 빛이 대물렌즈로 들어가지 않아 조명의 강도가 낮아집니다.

결론적으로, 고품질 현미경 대물렌즈의 발전은 Ernst Abbe로부터 시작되었습니다. Ernst Abbe는 1880년대 후반에 Carl Zeiss 및 Otto Schott와 함께 최초로 아포크로매트 대물렌즈와 보정 대안렌즈를 개발했습니다. 그 다음으로 대물렌즈 설계에서 획기적인 진전을 이룬 사람은1930년대 후반에 최초의 평면 아크로매트 및 평면 아포크로매트 대물렌즈를 만든 Hans Boegehold(Zeiss)입니다. 최근에는 Zenji Wahimoto(Nikon)와 Horst Riesenberg(Zeiss)가 "Chrome Free"(CF) 광학을 개발하여 현미경 대물렌즈 설계 분야를 새롭게 혁신했습니다.

오늘날 생산되고 있는 현미경 대물렌즈 중 다수는 적절한 대물렌즈를 선택하여 제대로 사용한다면 매우 낮은 수준의 수차와 기타 문제를 유발합니다. 그러나, 현미경 검사자는 모든 관점에서 완벽한 대물렌즈는 없으며, 대물렌즈는 용도, 물리적 규격의 제약, 가격 범위에 따라 특정 사양을 충족하도록 설계된다 점을 알아야 합니다. 따라서, 대물렌즈는 다양한 수준의 색수차 및 구면수차 보정 기능, 필드 크기와 평탄도, 투과 파장, 형광의 영향, 복굴절 및 배경 노이즈를 유발하는 기타 요인의 영향을 받습니다. 또한, 대물렌즈는 특정 튜브 길이 및 튜브 렌즈, 이멀젼 매체와 커버슬립의 유형 및 두께, 파장 범위, 필드 크기, 대안렌즈 유형 및 특수 집광기와 같은 특정 제약 조건에 따라 사용하도록 설계됩니다. 광학 현미경의 궁극적 목표는 미세한 표본을 세세하게 관찰할 수 있도록 유용한 수준의 배율을 제공하여 육안으로 볼 수 없는 대상의 숨겨진 세계를 드러내는 것입니다.