Hoffman 모듈레이션 콘트라스트(릴리프 콘트라스트라고도 함)는 플라스틱 용기에 들어 있는 오염되지 않은 살아 있는 물질의 콘트라스트를 높여 주는 광학 현미경 기술입니다. 이 기술은 광학적 구배를 감지한 후 이를 광도의 변화로 변환합니다.
이 게시물에서는 기본 현미경 구성부터 그 장점과 한계까지, Hoffman 모듈레이션 콘트라스트에 대한 자세한 내용을 살펴봅니다.
그림 1 Hoffman 모듈레이션 콘트라스트를 위한 기본 현미경 구성
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트를 위한 기본 현미경 구성
그림 1은 Hoffman 모듈레이션 콘트라스트에 대한 기본 현미경 구성을 보여줍니다. 광학 진폭 공간 필터(Hoffman의 “모듈레이터”)가 대물렌즈의 후 초점면에 삽입됩니다. 이 시스템을 통과하는 광도는 평균값 위아래로 변화한 후 변조됩니다. 모듈레이션 콘트라스트에 유용한 대물렌즈에는 10X, 20X, 40X의 전체 배율 범위가 포함될 수 있습니다.
모듈레이터에는 다음과 같은 3가지 영역이 있습니다(그림 2 참조).
- 후 초점면 주변의 작고 어두운 영역은 빛을 1%만 투과합니다(그림 2에서 D로 표시된 영역).
- 좁은 회색 영역은 빛을 15% 투과합니다(그림 2에서 G로 표시된 영역).
- 대물렌즈 뒤쪽 대부분의 영역을 덮고 있는 투명한 나머지 영역은 빛을 100%를 투과합니다(그림 2에서 B로 표시된 영역).
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트 현미경을 위한 모듈레이터와 슬릿
위상차 현미경의 위상판과 달리, Hoffman 모듈레이터는 영역을 통과하는 빛의 위상을 변경하지 않도록 되어 있습니다. 기본적으로 일반 명시야 현미경으로는 보이지 않는 투명한 물체가 모듈레이션 콘트라스트 광학 장치로 보면 위상 구배에 의해 3차원(3D)의 모양을 나타냅니다.
Hoffman 설계에서는 슬릿이 그림 1과 같이 콘덴서의 전 초점면에 있습니다. 빛이 축외 슬릿을 통과할 때 모듈레이터가 설치된 대물렌즈의 후 초점면(푸리에 평면이라고도 함)에서 영상화됩니다. 축외 슬릿판을 포함하는 콘덴서의 전 초점면은 대물렌즈의 후 초점면에서 모듈레이터에 광학적으로 결합됩니다. 영상 강도는 시료 광학 밀도의 1차 도함수에 비례하며 0차 위상 구배 회절 패턴으로 제어됩니다.
반대쪽 구배는 슬릿 영상이 모듈레이터의 매우 어두운 부분이나 밝은 부분으로 편향됩니다. 다음 예를 생각해 보세요. 양의 위상과 음의 위상(두께) 구배와 평평한(비구배) 영역을 모두 포함하는 가상 시료가 모듈레이션 콘트라스트 광학 부품을 사용하여 영상화됩니다. 양의 구배는 감쇠되지 않은 모듈레이터의 투명한 영역으로 빛을 편향시키고 이 빛을 100% 중간 영상면으로 투과합니다. 마찬가지로, 음의 구배에 의해 모듈레이터의 어두운 영역으로 편향된 빛은 이전 값의 약 1%로 감쇠됩니다.
시료에서 구배가 아닌 부분과 배경은 모듈레이터의 회색 부분으로 나타나며, 여기서 약 15%의 빛이 중간 영상면으로 투과됩니다. 결과적으로 구배의 한쪽에서 영상 영역의 강도가 어두워집니다. 구배 반대쪽 강도는 밝은 영상 영역을 만들고 구배가 아닌 영역은 배경과 마찬가지로 영상에서 회색으로 나타납니다.
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트의 4가지 주요 이점
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트에는 이점이 많지만 한계도 몇 가지 있습니다. Hoffman 모듈레이션 콘트라스트의 몇 가지 이점은 다음과 같습니다.
1. 대물렌즈의 개구수를 최대한 활용
더 높은 개구수와 함께 Hoffman 모듈레이션 콘트라스트를 사용할 수 있어 우수한 시료 콘트라스트 및 가시성과 함께 디테일에 대한 뛰어난 해상도를 얻게 됩니다.
2. 플라스틱 용기에서 작동
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트는 영상 왜곡 없이 플라스틱 접시 같은 복굴절 물질에 성공적으로 사용할 수 있습니다. 복굴절은 특정 물질에서 나타나는 현상으로, 입사 광선(표면에 부딪치는 광선)이 물질을 통과할 때 두 광선으로 분할되는 것을 말합니다.
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트는 복굴절 물질에서 잘 작동하지 않는 콘트라스트 방법 대신 사용할 수 있는 좋은 대안입니다. 예를 들어, DIC(Differential Interference Contrast)가 있는 복굴절 물질을 검사하면 아티팩트, 콘트라스트 손실, 기타 영상 품질 문제가 발생할 수 있습니다.
따라서, Hoffman 모듈레이션 콘트라스트는 플라스틱 용기에서 세포, 조직, 장기 배양을 관찰하고 영상화하는 데 적합한 방법입니다.
3. 광학적 절편화를 수행하는 능력
이 기술을 사용하여 “광학적 절편화”를 수행하는 것도 가능합니다. 절편화를 사용하면 초점을 맞추고 있는 평면의 위 또는 아래 영역에서 발생하는 혼란스러운 영상으로 인한 간섭 없이 시료의 얇은 단일면에 초점을 맞출 수 있습니다.
시료의 깊이는 현미경의 광축과 평행한 상태에서 측정됩니다. 영상의 초점을 맞추면 정확한 시료와 영상 간의 거리가 설정되어, 접안렌즈로부터 고정된 거리에 있는 미리 결정된 평면(영상면)에서 회절파의 간섭이 발생합니다. 이렇게 되면 콘트라스트가 충분한 경우 시료의 다양한 깊이 수준에서 발생하는 회절 물체를 독립적으로 볼 수 있습니다.
각 후속 면에 순차적으로 초점을 맞춰 시료의 전체 깊이를 광학적으로 절편화할 수 있습니다. 이 시스템에서 피사계 심도는 한 수준에서 뚜렷한 디테일의 영상이 발생하는 다음 수준까지의 거리이며, 대물렌즈의 개구수에 의해 제어됩니다. 개구수가 높은 대물렌즈는 매우 얕은 피사계 심도를 보여줍니다. 개구수가 낮은 대물렌즈의 경우는 그 반대입니다. 특정 광학 절편을 분리하고 특정 광학 절편에 초점을 맞추는 대물렌즈의 전반적인 기능은 시료의 광학적 균질성이 떨어질 때 감소합니다.
4. 가시성 향상
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트의 또 다른 이점은 가시성이 높다는 것입니다. 영상은 음영 또는 유사 3차원으로 나타나며, 디테일의 양쪽에 있는 콘트라스트 차이 때문에 가시성이 향상됩니다. 위상차 광학 장치로 생성된 영상과 달리, 이 영상에는 후광도 나타나지 않습니다. Hoffman 모듈레이션 콘트라스트는 위상 구배 정보를 위상차 현미경에서 생성된 위상 관계 변화(및 광학 경로 차이)와 매우 다른 진폭 차이로 변환합니다.
모듈레이터에서 어두운 영역과 회색 영역을 사용하면 다양한 회색 음영이 포함된 영상과 색상이 없는 영상을 생성할 수 있습니다. 그리고 동일한 투과율 값의 색상 영역을 대체하는 회색 영역과 어두운 영역으로 모듈레이터를 생성하여 모듈레이션 콘트라스트 영상에 색상을 적용할 수 있습니다. 이 경우, 위상 구배의 결과 영상은 동일한 색조의 유사한 구배로 색상이 렌더링됩니다. 현재는 색상 영역을 포함하는 모듈레이션 필터의 상업적 출처를 알지 못합니다.
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트의 한계
Hoffman 모듈레이션 콘트라스트에는 몇 가지 단점과 한계도 있습니다. 먼저, 이러한 영상은 주의해서 봐야 합니다. 유사 3차원 영상이 접안렌즈를 통해 관찰되므로 다른 관찰자가 영상의 “언덕”을 “계곡”으로 볼 수도 있고 그 반대로 볼 수도 있기 때문입니다. 이 시스템은 슬릿 길이에 수직인 구배에도 매우 민감합니다. 따라서 이 기술을 사용하여 최상의 효과를 내려면 시료를 배치할 때 어느 정도의 기술이 필요합니다.
