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암시야 현미경 검사는 오블리크(oblique) 조명을 활용하여 정상적인 조명 조건에서 제대로 이미징되지 않는 표본의 대비를 개선하는 기법입니다.
콘덴서의 가림막을 통해 직사광선을 차단한 후 경사각에서 표본을 통과하는 빛이 회절되고 굴절된 후 현미경 대물렌즈로 반사되어 어두운 배경에 중첩된 표본의 밝은 이미지를 형성합니다.
이 어두운 배경은 고대비를 제공하므로 배경이 난해한 표본을 비교적 쉽게 부각시킬 수 있습니다. 아래 이미지에서 일부 예를 확인하십시오.
누에 유충 숨구멍 및 기도. 목재 파편의 작은 조각들은 투과광 현미경을 사용한 암시야 조건에서 조명을 비추면 유난히 아름다운 모습을 띄게 됩니다.
왼쪽: 나비. 나비는 이 순서의 구성으로 나타나는 다양한 날개 비늘 패턴 때문에 곤충계에서도 가장 화려한 곤충으로 꼽힙니다. 이 디지털 이미지는 나비 날개 표면의 대다수를 장식하는 다양한 비늘 축소판을 보여줍니다. 날개 비늘은 스테이지 하단 암시야 콘덴서를 통해 조명을 비췄으며 저배율(50x)로 캡처되었습니다.
암시야 현미경 검사의 작동 원리는?
암시야 조명은 일반적으로 표본을 직접 통과하거나 표본 주변을 통과하는 대다수 광선을 차단하여 경사 광선만이 표본과 상호 작용하도록 해야 합니다.
단순한 Abbe 암시야 콘덴서의 상단 렌즈는 구형으로 오목하여 상단 렌즈 표면에서 나오는 광선이 표본 평면을 중심으로 반전된 속이 빈 원뿔 형태의 빛을 형성할 수 있습니다. 샘플이 없고 콘덴서의 개구수(NA)가 대물렌즈보다 큰 곳에서는 경사 광선이 서로 교차하여 대물렌즈를 빗나가므로 해당 영역이 어둡게 됩니다.
표본(특히 비염색, 비광흡수성 표본)을 슬라이드에 놓으면, 경사 광선이 표본과 상호 작용하여 세포막, 핵 및 내부 세포기관과 같은 샘플의 여러 요소로 인해 회절, 반사 및/또는 굴절됩니다. 따라서 이 희미해진 광선이 대물렌즈에 들어오게 됩니다. 그 결과가 검은 배경에 놓이는 밝은 표본입니다.
암시야 현미경 검사에 필수적인 구성 요소는?
거의 모든 명시야 실험실 현미경을 쉽게 개조하여 암시야 조명을 적용할 수 있습니다. 이 작업을 수행하는 가장 손쉬운 방법은 현재 콘덴서를 암시야 조명 전용 콘덴서로 교체하는 것입니다(그림 1).
이 콘덴서는 비교적 단순하면서도 암시야에 필요한 조명 원뿔을 만드는 데 필요한 높은 개구수(NA)를 제공합니다. 하지만 조명 유형에 따라 콘덴서 전환이 일상적인 현미경 용도에 실용적이지 못합니다. 다행히 해결책이 있습니다.
많은 콘덴서는 조명 원뿔을 만드는 인서트를 수용할 수 있습니다. 이 인서트는 전용 암시야 콘덴서만큼 높은 NA를 제공하지 않으므로 모든 대물렌즈를 사용할 수 없습니다. 그렇지만 인서트를 사용하면 동일한 콘덴서에서 여러 관찰 방법을 유연하게 사용할 수 있습니다.
그림 1. 암시야 조명용 콘덴서
암시야 현미경 검사가 우수한 이미징 기법인 이유는?
일반적으로 적절한 암시야 조명 조건에서 촬영된 물체들은 굉장히 멋진 모습을 보입니다. 흔히 명시야 현미경 검사에서 매우 낮은 고유 대비를 포함하는 표본은 암시야에서 화려하게 빛납니다.
암시야 조명은 윤곽, 가장자리, 경계 및 굴절률 경사화를 표시하는 데 가장 적합합니다. 암시야 조명에 적합한 후보 표본에는 살아 있는 미세 수생생물, 규조, 작은 곤충, 뼈, 섬유, 털, 염색하지 않은 박테리아, 효모, 조직 배양 중인 세포, 원생동물 등이 있습니다.
비생물학적 표본에는 광물 및 화학적 결정, 콜로이드 입자, 분진 계수 표본뿐 아니라, 작은 함유 성분, 다공성 차이 또는 굴절률 경사화를 포함하는 폴리머 및 세라믹의 얇은 부위가 있습니다.
다음은 암시야 이미징을 사용하여 캡처한 표본의 몇 가지 예입니다.
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왼쪽: 규조류 Arachnoidiscus ehrenbergi의 이 화려한 암시야 현미경 사진은 Mortimer Abramowitz가 올림푸스 현미경을 사용하여 캡처했습니다. 이 표본은 현미경 슬라이드와 대물렌즈 및 콘덴서 전면 렌즈 사이에 이멀전 오일이 적용된 높은 개구수(NA) 암시야 콘덴서를 사용하여 조명을 비췄습니다. 참피나무. 염색한 표본은 흔히 암시야 현미경 검사에 최적의 후보로서 어두운 배경에서 컬러로 표현되는 멋진 이미지를 만들어 냅니다. 이 현미경 사진는 암시야 조명을 적용한 참피나무의 염색한 얇은 부위를 나타냅니다. 오른쪽: 액정 DNA. 이 고농축 DNA 용액은 일련의 액정상 변화를 거쳐 밀도 높은 육각형상을 형성합니다. 이 현미경 사진은 암시야 조명에서 10x 대물렌즈를 장착한 복합 광학 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. |
안타깝게도 암시야 조명은 내부 세부 사항을 표시하는 데 있어 그 유용성이 떨어집니다. 또한 암시야 조명을 최대한 활용하려는 경우 다른 조건도 고려해야 합니다.
암시야 현미경 사용에 따른 과제는?
초점 평면 위와 아래에 있는 형상은 빛을 산란시켜 이미지를 저하시킬 수 있기 때문에 암시야 현미경 검사용 표본을 준비할 때에는 주의를 기울여야 합니다. 슬라이드의 청결도는 이미징 시 중요한 요소이지만, 암시야에서는 모든 파편 조각에 조명이 비춰져 확인하려는 대상이 드러나지 않을 수 있기 때문에 훨씬 더 중요합니다.
암시야에서 현미경을 설정할 때 직면할 수 있는 다른 과제는 다음과 같습니다.
조명 부족으로 인해 표본을 볼 수 없거나 보이더라도 매우 희미하게 보임.
암시야 현미경 검사에서는 원뿔을 형성하기 위해 많은 빛이 차단되기 때문에 적절한 이미징을 위해서는 많은 빛이 필요합니다. 따라서 주저하지 말고 전원을 켜야겠지만, 일부 샘플에서는 장시간 동안 그렇게 많은 빛을 비추면 좋지 않을 수 있습니다.이 슬라이드에는 시야 중심에 어두운 스폿이 있지만 주위 물체는 밝게 비추어 정상적으로 보입니다.
이 문제는 일반적으로 콘덴서 정렬이나 초점이 부적절할 경우에 발생합니다. 콘덴서를 중심에 배치하고 포커싱하면 이 문제가 해결됩니다. 이 해결책은 조명이 불균일하게 나타나고 샘플이 초점에 있는 경우 대다수 문제에 적용됩니다.배경이 컬러로 나타나거나 회색 주물과 함께 불균일하게 비춰집니다.
이 문제는 흔히 샘플이 너무 두껍거나 오염된 배지에 놓여 있기 때문에 발생합니다. 샘플을 다시 놓으면 도움이 됩니다.
암시야 현미경 사용의 이점은?
암시야 현미경 검사에는 다양한 이점이 있습니다. 배경이 어두워 대비가 높아 난해한 배경에서도 샘플을 쉽게 볼 수 있습니다. 이 기법은 많은 명시야 실험실 현미경을 암시야 조명에 맞게 구성할 수 있기 때문에 쉽게 이용할 수 있습니다. 현미경 검사상의 이점 외에도, 암시야 이미지는 샘플이 멋지게 조명되어 예술 작품처럼 보일 수도 있습니다.
