스페인 톨레도에 있는 Hospital Nacional de Parapléjicos(HNP)는 스페인 국립 척수 손상 레퍼런스 센터입니다.HNP의 목표는 척수 손상 환자에게 종합적인 건강 및 재활 서비스를 제공하고 자격을 갖춘 인력을 양성하며 신경과학 분야의 과학 연구를 수행하는 것입니다.
신경과학 연구를 지원하기 위해 HNP는 현미경 및 이미지 분석, 유세포 분석, 프로테오믹스, 소동물을 위한 핵자기공명(NMR), 그리고 동물 거주를 위한 핵심 시설을 제공합니다.현미경 및 이미지 분석을 위한 병원 시설에는 현미경 한 대를 사용한 전체 슬라이드 스캐닝과 고함량 스크리닝(HCS)을 지원하는 강력한 다중 모드 솔루션이 포함됩니다.
이 솔루션은 IXplore™ Pro 자동 현미경 시스템을 scanR 고함량 스크리닝 소프트웨어* 및 cellSens™ 이미징 소프트웨어와 결합합니다.TruAI™ 딥러닝 기술을 사용한 고급 이미지 분석을 포함하여 다양한 응용 분야 및 이미징 기술에 채택할 수 있습니다.
그림 1.스페인 톨레도에 있는 Hospital Nacional de Parapléjicos의 전경. 사진 제공: Juan Carlos Monroy.
Hospital Nacional de Parapléjicos의 현미경 및 이미지 분석 시설은José Ángel Rodríguez Alfaro 박사와Javier Mazarío 박사가 관리합니다.저희는 이 시설의 중앙 서비스부에서 scanR 및 cellSens 소프트웨어가 포함된 IXplore Pro 시스템을 사용한 이들의 경험에 대해 자세히 알아보기 위해 최근 이들과 대화를 나눴습니다.
Q: 귀하의 시설에서 scanR 소프트웨어가 포함된 IXplore 현미경 시스템을 사용하기로 고려한 이유는 무엇입니까?
A: 우리 시설에는 자동 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 수동 일상 현미경에 이르는 다양한 광학 현미경이 있습니다.저희는 10년 동안 사용하던 폐쇄형 고함량 분석(HCA) 시스템이 고장이 나 이 시스템을 교체해야 했습니다.
당시 우리는 HCA 시스템으로 얻은 측정값의 정교한 게이트 분석을 수행할 수 있도록 해당 시스템으로 얻은 데이터를 유세포 분석 소프트웨어로 내보내는 방법을 찾고 있었습니다.
scanR 시스템에서 첫 번째로 우리의 관심을 끌었던 부분은 이러한 종류의 세포계측 게이트 분석이 이미 소프트웨어에 내장되어 있다는 점입니다.저희는 이러한 종류의 분석을 수행할 수 있는 다른 HCA 시스템을 찾지 못하고 있었습니다.이 점이 scanR 소프트웨어가 포함된 IXplore 시스템에 마음이 기울게 된 핵심 요소 중 하나였습니다.
Q: 시스템의 어떤 다른 기능이 마음에 들었습니까?
A: 폐쇄형 시스템이 아니라서 cellSens 소프트웨어를 사용하면 슬라이드를 스캔할 수 있는 광시야 현미경도 갖게 된다는 사실이 마음에 들었습니다.이 시스템의 2-in-1 구성은 우리 시설에서 제공하는 서비스의 다양성을 늘릴 수 있기 때문에 저희에게 완벽하게 맞았습니다.
이 시스템의 모듈성은 매우 편리합니다.그래서 생세포 연구를 위한 배양기 통합과 같이 더 많은 기능이 필요한 경우 이러한 기능을 추가할 수 있습니다.
또 다른 핵심 요소는 cellSens 및 scanR 이미지에서 작동할 뿐 아니라 다른 현미경 시스템으로 획득한 이미지에서도 작동하는 TruAI와 같은 최첨단 인공 지능 이미지 분석 기술을 포트폴리오에 통합할 수 있다는 가능성이었습니다.
Q: IXplore 시스템을 추가한 후 시설에 어떤 영향이 있었습니까?무엇이 바뀌었나요?
A: scanR 소프트웨어와 결합된 IXplore 시스템은 곧 우리 시설에서 가장 많이 사용되는 현미경이 되었습니다.사용 시간이 시설의 과거 “스타”였던 공초점 현미경의 두 배를 넘습니다.
비록 표면형광 현미경이지만 연구자가 일부 연구를 위해 공초점 이미징에서 갈아타는 것을 고려하기에 충분할 정도의 이미지의 분해능을 자랑합니다. 특히 시스템의 빠른 속도를 고려하고 Z 분해능을 그다지 많이 고려하지 않는 경우에는 더욱 그렇습니다.그래서 연구자들은 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로는 획득하기까지 시간이 너무 많이 걸렸던 이미지를 캡처할 수 있게 되었습니다.
이미징 속도가 빨라질 뿐 아니라 초점 맵과 함께 4개 슬라이드 캐리어를 사용하여 실험을 설정하면 지켜보는 사람 없이도 하룻밤 사이에 이미지를 획득할 수 있는 가능성도 있습니다.
scanR 소프트웨어로 데이터를 획득하는 동안 즉석에서 데이터 분석을 실행할 수 있는 가능성은 이전에 저희가 갖고 있던 HCA 시스템과 비교할 때 또 하나 크게 개선된 사항입니다.이미지 캡처가 완료되는 즉시 분석 결과를 받고 다음 샘플을 분석할 수 있습니다.
또한 TruAI 딥러닝 기술은 또한 매우 유용한 도구임이 입증되었습니다.고밀도 세포 배양 샘플의 핵 검출은 표준 분할 기술 대비 크게 개선되어 사용자가 실험에서 더 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다.
Q: 시설에서 cellSens 소프트웨어가 포함된 IXplore 시스템을 사용한 예를 들어주실 수 있습니까?연구자들은 이미지에서 무엇을 보고 싶어 하나요?
A: 저희는 마우스, 래트, 심지어 돼지에 대해서도 척수 횡단면의 고분해능 이미지를 획득하는 경우가 많습니다. 이러한 이미지에서 연구자들은 신경교 세포 집단, 뉴런의 생존 또는 척수 손상(SCI) 후 다양한 표지의 발현에 변화가 있는지는 물론, 병변 부위에서 축색 돌기가 성장하는지를 확인합니다.
그러나 척수 조직 스캔에만 국한하여 수행하지는 않습니다.뇌 절편의 고분해능 스캔도 수행합니다.이 예에서는 형광 리포터 유전자 mCherry의 발현 위치를 찾기 위해 차등 간섭 대비(DIC)를 사용하여 마우스 뇌의 절편 전체를 스캔했습니다.
그림 2.DIC와 형광을 사용한 마우스 뇌의 전체 슬라이드 이미지.이미지 제공: HNP의 실험 신경생리학 및 신경 회로 그룹.14
그림 3.이전 이미지의 한 영역에 대한 근접 촬영.이미지 제공: HNP의 실험 신경생리학 및 신경 회로 그룹.18
Q: 시설에서 scanR 소프트웨어를 HCA 용도로 사용한 예를 들어주실 수 있습니까?연구자들은 데이터에서 무엇을 보고 싶어 하나요?
A: HCA는 다양한 조건에서 세포 증식, 분화 및 이동 연구에 매우 자주 사용됩니다.우리 시설에서 scanR 소프트웨어로 가장 자주 수행하는 분석 중 하나는 다양한 처리하에서 리포터 유전자(GFP 및 mCherry)의 발현을 검출하는 것입니다.저희는 고밀도 세포 배양에서 핵 분할을 위해 TruAI를 사용하고, 게이트 분석과 결합하여 모집단에서 단일 및 이중 표지된 세포의 수를 정량화하고 다양한 처리의 작동 방식을 평가합니다.
또한 혈액 및 정자 샘플의 형광제자리부합법(FISH) 검출에 이 시스템을 사용했습니다.이 경우 핵 분할에 TruAI를 사용할 뿐 아니라 핵 내 FISH 위치를 검출하는 데도 사용합니다.
그림 4.산점도와 히스토그램으로 둘러싸인 세포와 핵의 분할을 보여주는 scanR 소프트웨어의 기본 창.2차원 산점도에서 각 점은 분할된 세포를 나타냅니다.1차원 히스토그램에서 각 선은 매개변수값을 나타내며 해당 값을 가진 세포 수에 대한 선의 높이에 해당합니다.첫 번째 산점도에서 게이트(R01)는 세포의 크기와 모양에 따라 세포의 하위 모집단을 선택하고 다음 분석 플롯으로 전송됩니다.R01 외부의 세포는 폐기됩니다.두 번째 및 세 번째 분석 플롯에서 양성 녹색 세포(R02)와 양성 적색 세포(R03)의 게이트가 생성됩니다.최종 분석 플롯에서 R01, R02, R03을 결합하여 단일 및 이중 양성 세포의 백분율을 얻습니다.데이터 제공: HNP의 분자 신경학 그룹.22
그림 5.scanR 소프트웨어를 사용하면 게이트 영역에서 갤러리를 만들 수 있습니다.예시는 이중 음성, 단일 양성 녹색, 단일 양성 적색, 이중 양성 녹색-적색 등의 세포 모집단에 대한 갤러리를 보여줍니다.결과를 표로 내보내거나 웰 플레이트의 맥락에서 히트맵으로 시각화할 수 있습니다.데이터 제공: HNP의 분자 신경학 그룹.
Q: 자체 딥러닝 신경망 모델을 개발하기 위해 TruAI 기술을 사용하시나요?
A: 그렇습니다.저희는 밀집된 세포의 핵 분할, 척수 절편의 뉴런 검출, 다양한 종류의 근섬유 분류, 특정 치료 후 비정상 핵 인식 등을 위해 모델을 훈련시켰습니다.
이는 소프트웨어에서 가장 마음에 드는 점 중 하나입니다. 이 시스템으로 획득한 이미지뿐 아니라 Olympus 외 제작업체의 현미경으로 획득한 이미지에서도 신경망 모델을 쉽게 훈련할 수 있습니다.그리고 이제 무료 시각화 앱인 OlyVIA를 사용하여 이미지에 주석을 달 수 있어 훨씬 더 편리합니다. 사용자가 사무실이나 심지어 집에 있는 자신의 컴퓨터에서 주석을 달 수 있기 때문입니다.
그림 6.왼쪽 이미지는 마우스 척수 절편의 신경 표지 NeuN(녹색)을 보여줍니다.오른쪽 이미지는 동일한 절편에 대한 레이어로 NeuN 양성 세포(분홍색)의 TruAI 검출을 보여줍니다.이미지 제공: HNP의 분자 신경보호 그룹.28
Q: 시스템에서 가장 마음에 드는 점은 무엇입니까?
A: 이전에 언급했듯이 이 시스템에는 마음에 드는 점이 많습니다.그중 가장 놀라운 점은 cellSens와 scanR 소프트웨어를 결합하여 현미경 시스템 하나만으로 전체 슬라이드 스캐닝에서 HCA를 활용할 수 있다는 것입니다.이 2-in-1 구성은 우리 시설의 리소스 최적화에 안성맞춤입니다.물론 두 시스템과 완벽하게 호환되는 TruAI도 있습니다.TruAI를 통하면, 어떤 모델을 훈련에 사용했는지에 관계없이 두 소프트웨어 모두에서 신경망 모델을 사용할 수 있습니다.
IXplore 현미경 시스템에 대해 자세히 알아보기
IXplore 현미경 시리즈는 다양한 생명 과학 연구 분야에 맞게 조정된 도립 현미경을 말합니다.IXplore Pro 전동식 도립 현미경에는 명시야, 다중 채널 형광, Z 스태킹, 스티칭 기능이 포함됩니다.
IXplore 시스템은 광시야 현미경에서 다양한 분야와 이미징 기술에 채택할 수 있는 Olympus 카메라 기반 현미경용 플랫폼인 cellSens 소프트웨어로 제어합니다.이 시스템에는 일상 현미경 검사, 회전 디스크 공초점, 초고분해능, 내부 전반사 형광(TIRF), 광표백 후 형광 회복(FRAP) 등이 포함됩니다.
선택한 하드웨어를 사용하여 동일한 IXplore 현미경을 scanR 소프트웨어로 제어할 수도 있습니다. 이 소프트웨어는 웰 플레이트와 챔버 슬라이드의 고함량 스크리닝 분야 전용으로 간소화되었습니다.
인터뷰 대상자
인터뷰에 응하여 제품 경험담을 말씀해주신스페인 Hospital Nacional de Parapléjicos의 현미경 및 이미지 분석 핵심 시설 관리자인José Ángel Rodríguez Alfaro 박사와 Javier Mazarío 박사께 감사드립니다.해당 시설에 대한 질문은 microscopia.hnp@sescam.jccm.es로 이메일을 보내주세요.
José Ángel Rodríguez Alfaro 박사와Javier Mazarío 박사, 스페인 Hospital Nacional de Parapléjicos의 현미경 및 이미지 분석 핵심 시설 관리자.
*일본에서는 scanR 시스템을 사용할 수 없습니다.
