탈미엘린화 이후 7일 동안 복구된 쥐류 기관형 소뇌 슬라이스. 축삭돌기는 신경미세섬유-H(Neurofilament-H)를 녹색으로 표시하여 시각화했으며, 미엘린은 수초
염기성 단백질을 빨간색으로 하여 표지했고, GSTpi는 파란색으로 표지된 희소돌기아교세포 세포체로 표시되었습니다. 샘플 제공: Katherine Given, MS, 콜로라도대학교
덴버캠퍼스(University of Colorado Denver). SILA 모듈을 적용한 SLIDEVIEW VS200 연구용 슬라이드 스캐너에서 20배율로 캡처했습니다.
광시야 형광 현미경은 얇은 샘플을 고해상도로 이미징할 수 있습니다. 그러나 두꺼운 샘플의 경우 배경 형광이 이미지를 흐려지게 하므로 광시야 현미경의 이미징 성능은 제한적입니다.
그렇다면 두꺼운 샘플에서 이미지 흐려짐을 어떻게 방지해야 할까요? 그 해답은 광학 절단에 있습니다. 이 방법은 광시야 이미징의 한계를 효과적으로 극복하지만, 지금까지 컨포컬 시스템 또는 흐려짐 제거 소프트웨어를 필요로 했습니다.
현재, 광학 절단 기술이 연구 슬라이드 스캐너에 활용되고 있습니다. 따라서 연구자들은 처리량을 대폭 향상시키면서 두꺼운 샘플의 이미징을 지원하는 컨포컬 기능을 유용하게 활용할 수 있습니다. 이 글에서는 이러한 광학 절단 방법의 장점을 자세히 알아보고 이 방법을 기존 방법과 비교해 보겠습니다.
두꺼운 샘플에 광시야 이미징을 수행할 때 한계점은 무엇일까요?
광시야 현미경 검사는 얇은 샘플(<10µm)에 매우 효과적인 일반적인 이미징 기법입니다. 광시야 현미경 검사에서는 초점이 맞은 평면과 맞지 않은 평면의 빛이 모두 카메라에 의해 수집됩니다. 이는 얇은 샘플의 경우 문제가 되지 않습니다. 그러나 두꺼운 샘플을 이미징할 때는 이러한 불가피한 배경 형광으로 인해 이미지가 흐려지고 대비가 악화되어 관심 구조가 모호해집니다.
컨포컬 현미경 검사와 기타 스캐닝 조명 방법은 이러한 문제를 극복할 있습니다. 즉, 조명을 고정된 패턴으로 비추어 광학적으로 절단된 이미지를 만들 수 있습니다. 이러한 시스템들은 유리한 조건이 충족되면 탁월한 이미지를 생성할 수 있습니다. 그러나, 비용이 상당히 비싸며, 샘플에 잘 정의되고 통제된 조명 패턴이 전달되어야 제대로 성능을 발휘할 수 있습니다.
두꺼운 샘플 이미징을 위한 다른 조명 접근법 소개
배경 형광이 이미지 대비와 품질에 주는 영향을 방지하기 위해 잘 정의되고 통제된 조명 패턴이 항상 필요한 것은 아닙니다. HILO 현미경 검사라는 기법은 무작위 스페클 패턴을 사용하여 형광 샘플에 조명을 비춥니다. 스페클 패턴은 내재적으로 높은 대비와 함께 과립형 강도를 보이므로 스페클 조명을 통해 얻은 형광 이미지는 과립 구조로 보입니다. 이러한 과립성은 대비를 향상시키고, 샘플에 어느 정도로 초점이 맞았는지를 직접적으로 보여줍니다.
HILO 이미징 과정에서 두 개의 미가공 이미지가 수집 및 처리됩니다. 첫 번째는 균일한 조명을 사용하는 일반 광시야 이미지입니다. 고주파(high-frequency, HILO 현미경 검사에서 ‘HI’를 나타냄) 정보를 추출하기 위해 이 이미지에 고역 필터가 적용됩니다. 이 단계는 초점이 맞은 정보와 맞지 않은 정보 모두를 포함하여 저주파 정보를 제거합니다.
두 번째 이미지는 초점이 맞은 저주파(low-frequency) 이미지 정보를 복구하기 위해 스페클 조명을 사용하여 캡처됩니다. 다시 말해, HILO 현미경 검사에서 ‘LO’에 해당됩니다. 이 이미지는 초점이 맞은 정보를 추출하고 배경 형광을 제거하는 알고리즘을 사용하여 처리됩니다. 그 다음, 이 이미지가 함께 결합되어(그림 1) 전체 주파수 범위의 정보를 포함한 이미지를 만들고, 초점이 벗어난 빛은 제거됩니다.
SILA 광학 절단 장치는 HILO 현미경 검사 기반의 SLIDEVIEW™ VS200 연구 슬라이드 스캐너를 위한 고처리량 이미징 솔루션입니다. 이 장치는 초점을 벗어난 빛을 제거하는 광시야 현미경용 애드온 기술입니다. 이 기술은 컨포컬 현미경 검사와 동일한 날카로운 광학 절편을 만든다는 점에 주목할 만합니다. SILA 장치는 어느 VS200 시스템에든 쉽게 추가할 수 있습니다. 그리고 두꺼운 샘플에 대한 고품질 광학 이미징을 요구하는 다양한 응용 분야에 이점을 제공합니다.
그림 1. 20배율로 촬영한 생쥐 신장 절편. VS200 스캐너의 SILA 장치는 균일하게 조명이 비춰진 이미지를 스페클 조명 이미지와 결합하여 날카로운 광학
절편으로 결합된 이미지를 제공합니다.
한 가지 매개변수를 사용한 조정 가능한 광학 절단
SILA 장치는 수학적으로 기존 광시야 이미지와 스페클 이미지를 처리하므로 하나의 절편 두께(sectioning thickness, ST) 매개변수를 사용하여 광학 절단의 정도를 조정할 수 있습니다. ST가 높게 설정된 경우, 이미지는 더 큰 피사계 심도에서 정보를 표시합니다. 이 때문에 광시야 이미지처럼 보입니다.
그림 2는 ST5에서 만들어진 뇌 절편을 보여줍니다. 이처럼 높은 ST 값에서는 초점을 벗어난 영역이 많이 남아 있게 됩니다. ST 값이 감소함에 따라, 이미지는 낮은 피사계 심도에서 정보를 표시합니다. 그러므로 ST2 및 ST1에서 만들어진 뇌 절편을 관찰할 때, 초점이 맞은 정보가 남아 있게 되고, 초점을 벗어난 요소는 사라집니다.
이와 같은 방식으로 광학 절단을 최적화하면 배경 형광을 제거하면서 여러 심도에서 시각화를 수행할 수 있습니다. 이러한 VS200 스캐너 SILA 장치의 기능은 핀홀 크기를 변경하여 비슷한 효과를 낼 수 있는 컨포컬 현미경 시스템과 유사합니다.
그림 2. tdTomato로 표지되고, 20배율로 획득된 생쥐의 뇌 샘플
두꺼운 샘플의 흐릿함 제거: SILA 이미징과 다른 기법 비교
SILA 장치가 개발되기 전에, VS200 스캐너에는 광시야 이미지의 초점을 벗어난 빛을 제거하는 다른 솔루션이 있었습니다. TruSight™ 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하면 2D 제한된 반복(constrained iterative, CI) 알고리즘을 통해 이미지를 디콘볼루션할 수 있습니다. 이러한 소프트웨어 기반 접근법은 초점을 벗어난 빛을 일부 제거하는 데 효과적입니다. 하지만, SILA 모듈에서 사용되는 소프트웨어 및 하드웨어 결합 접근법만큼 초점을 벗어난 빛을 제거하지 못할 뿐만 아니라 광학 절편 최적화도 수행하지 못합니다.
그러나, 디콘볼루션은 SILA 광학 절단을 사용하지 못하는 얇은 샘플을 관찰할 때 활용 가능한 중간 옵션을 제공하긴 합니다. 기존의 광시야, 소프트웨어 디콘볼루션 및 SILA 이미지의 품질 차이는 그림 3에서 확인할 수 있습니다.
그림 3. 창자가 보이는 20배율로 촬영된 완전한 플라나리아 편형동물(Schmidtea mediterranea) 파란색: DAPI. 녹색: 내부 창자 세포. 빨간색: 외부 창자 세포. 샘플 제공: Amrutha Palavalli,
독일 괴팅겐 Max Planck 연구소, 조직 역학 및 재생 부서.
SILA 이미징 응용 분야: 두꺼운 세포층부터 조직 샘플까지
SILA 광학 절단 기술은 특히 고정된 두꺼운 세포층 및 조직 샘플의 이미징 등 다양한 연구 분야에 상당한 가치를 가져다줍니다. 절단 최적화 기능과 컨포컬 현미경과 동등한 흐릿함 제거 및 이미지 대비 기능을 함께 사용하는 SILA는 처리량이 대폭 향상된 고품질 이미징을 제공합니다.
두꺼운 샘플을 이미징할 수 있는 기능은 표본의 형태를 보존하기 위해 두꺼운 조직 절편이 필요한 경우가 많은 신경과학 이미징 분야에서 장점으로 작용합니다. 뇌 절편 이미징은 어렵다고 알려져 있습니다. 뇌 조직은 빛을 산란시키는 효과를 내는 경향이 있으므로 특히 어렵습니다.
전통적으로, 고품질의 고대비 이미지를 캡처하려면 컨포컬 또는 2광자 현미경 검사 시스템이 필요했습니다. 그러나 이러한 시스템으로 뇌 절편과 같은 큰 영역을 이미징하려면 상당한 시간이 소요되었습니다. SILA 장치가 장착된 VS200 시스템은 자동 슬라이드 스캐닝을 제공하므로 두꺼운 샘플의 큰 영역을 훨씬 더 빨리 이미징할 수 있습니다. 따라서 적은 시간으로 고품질 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 4).
그림 4. 200μm의 생쥐 뇌 절편. 4배율로 획득한 개요. 세부 스캔은 20배율로 획득한 47µm Z-시리즈의 확장 초점 이미지(EFI)입니다. 파란색: DAPI. 녹색: GFAP(아교세포).
노란색: MAP2(뉴런).
오가노이드 이미징은 신경과학 분야에 유사한 과제를 제시하므로 오가노이드 연구는 SILA 이미징을 유용하게 활용할 수 있는 또 다른 분야입니다. 오가노이드를 이미징하는 일은 두꺼운 샘플 때문에 어렵습니다. 그리고 오가노이드 형태를 제대로 조사하려면 큰 영역을 이미징해야 합니다.
전체 슬라이드 스캐너인 SILA 모듈이 장착된 VS200 시스템은 이러한 큰 샘플의 이미징을 지원할 수 있습니다. 한편, 이 시스템은 자동 이미지 처리, 샘플 의존적 점 확산 함수(PSF) 그리고 단순한 워크플로를 제공하므로 빠른 이미지 획득이 가능합니다. SILA 장치는 또한 암 연구, 공간 생물학, 식물학, 발생학 및 두꺼운 샘플의 큰 영역에 대한 고품질 이미징이 필요한 기타 다수의 응용 분야에도 가치를 제공합니다.
SILA 이미징에 대한 주요 요점
SILA 이미징은 정교한 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경과 동등한 수준으로 광학 절단을 최적화하고, 샘플의 흐릿함을 감소시키고, 이미지 대비를 향상시킬 수 있습니다. 컨포컬 시스템에 비해 대폭 향상된 처리량을 제공하는, SILA 장치를 장착한 VS200 슬라이드 스캐너는 전통적으로 이미징이 어려웠던 큰 샘플을 빠르게 이미징하도록 지원하여 신경과학, 오가노이드 연구 등에 상당한 이점을 제공합니다.
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