Olympus에 몸담고 있는 동안 나는 DIY로 만든 샘플 홀더에서 실험 기구까지 고객들의 창의적인 컨포칼 현미경 셋업에 놀랐습니다. FV3000 컨포칼 현미경이 정립 구성과 도립 구성으로 나오기 때문에 여러 방식으로 샘플을 수용하고 적응시킬 수 있습니다.
FV3000 현미경은 형광 관찰용으로 설계되어 있습니다. 하지만 약간 독창적으로 사용하면 일부 경우에서 반사 컨포칼 이미징도 수행할 수 있습니다. 반사 컨포칼 이미징 기법은 그 다양성 및 실용성에도 불구하고 종종 무시되므로 시스템을 최대한 활용하는 데 도움이 되도록 이 기법을 사용하기 위한 방안에 대해 논의할 것입니다.
생물학적 조직에서 내생적 정보를 추출하기 위해 반사 컨포칼 이미징을 사용할 수 있는 방법을 강조할 것입니다.
원섬유 생체 분자 복합체의 반사 컨포칼 이미징
반사광 경로에 대한 한 가지 용도는 샘플 환경의 추가된 대비 및 인식을 위한 내생 신호를 캡처하는 것입니다.
작동 방법은 다음과 같습니다. 생물학적 미소섬유 단백질 구조와 물의 상호작용에서 강력한 반사 대비 신호가 생성됩니다. 중첩 대역폭으로 설정된 TruSpectral 검출기에 여기광을 단순히 디스캔(descan)하면 특정 세포 구조, 세포외 매트릭스 환경의 조직 상태 또는 재료 표면 특성을 식별할 수 있습니다.
편리하게도 FV3000 컨포칼 현미경은 완전히 스펙트럼 기반 광 경로를 특징으로 하므로 모든 채널이 반사율 검출에 사용될 수 있습니다. 형광 관찰과 결합 시에 이 추가된 다중스펙트럼 반사 기능은 표지되지 않은 세포 구조의 위치를 추출할 수 있습니다.
다음 예를 고려하십시오. EnCor Biotechnology, Inc.에서 제공한 면역형광 표지된 고정 쥐 뇌 부분 슬라이드의 이미지를 획득하였습니다. 아래 이미지에서 볼 수 있듯이(그림 1), 표준 3채널 VBF 획득은 뉴런 수지상 돌기(주황색)의 뛰어난 에피토프별 표지, 도파민 또는 노르에피네프린이 포함된 카테콜아민성 뉴런(마젠타색) 및 핵 염색(청록색)을 제공하는 염색 삽입을 나타냅니다.
그림 1: EnCor Biotechnology, Inc.의 항체로 착색된 3색 면역형광 표지된 쥐 뇌 부분. 상단 패널: X 라인 20X 대물렌즈로 획득된 전시야 단일 Z 평면 이미지. 하단 패널: 강조표시된 삽입 사각형의 실제 픽셀 해상도
면역형광 준비에 의해 생성된 강력한 광역 스펙트럼 형광 배경에도 불구하고 반사 기술을 사용하여 더 많은 내생적 정보를 뽑아낼 수 있습니다.
레이저 라인 405, 488, 561 및 640nm의 반사율의 이미지를 획득하기 위해 4개 채널을 동시에 사용하여 이 조직 내 골수 신경세포의 다중스펙트럼 지도를 만들 수 있습니다 . 아래 이미지들에서 이것이 어떤 모습인지 확인할 수 있습니다(그림 2 및 3).
 그림 2(좌측): 그림 1에 표시된 면역형광 파생 신호의 3개 채널 병합. 우측: 레이저 라인 405, 488, 561 및 640nm를 사용하여 동시 획득된 반사 컨포칼 이미징의 동일한 시야 4개 채널 병합 이미지. |  그림 3(상단): 동시에 획득된 각 라인의 개별 반사 컨포칼 이미지. 하단: 면역형광 표지된 도파민 함유 신경세포의 병합 이미지 및 내생 축색돌기 수초형성의 다중스펙트럼 반사 컨포칼 이미지. |
이 무표지 정보를 사용하여 면역형광에 의해 선택적으로 표지된 관심 신경세포에서 발생되는 수초형성 정도를 판단하거나 축색돌기 추적이 요구되는 용도를 도울 수 있습니다.
또한 반사 컨포칼 이미징을 사용하여 3D 배양 조직 모델의 세포외 매트릭스를 밝힐 수 있습니다. 아래 이미지에서 볼 수 있듯이(그림 4), 혈관형성 중 생장하는 인공혈관이 기질 환경의 주위 콜라겐 원섬유와 긴밀하게 상호작용합니다.
그림 4: 콜라겐 매트릭스 내 3D 인쇄된 혈관의 Z 투사. 상단: 로다민 표지된 내피 세포의 형광 컨포칼 이미지. 중앙: 혈관 근위의 근모상 콜라겐 네트워크 및 리모델링 영역을 보이는 405nm 반사 컨포칼 이미지. 하단: 병합 이미지. 기준자 = 100µm.
Advanced Solutions Life Sciences’ Angiomics™ 고립 미세혈관을 사용하여 FV3000 컨포칼 현미경으로 체외 자생 혈관형성을 재현하면 혈관형성 신경혈관(컨포칼 형광을 통해 시각화됨)이 3D 기질 환경을 통해 생장하면서 즉시 인접 콜라겐 원섬유(반사 이미징을 사용하여 시각화됨)를 재조직하는 것이 분명합니다.
