형광 이미징은 처음 도입된 이래로 생물학 연구의 필수 도구가 되었습니다.형광 이미징은 수많은 과학자들이 현미경 수준에서 세포 구조 및 동적 과정을 시각화하는 데 도움을 주었습니다.
형광 현미경을 사용하여 생물학 샘플을 이미징한 경험이 있다면, 조직에 스며들어 있는 희미하고 널리 퍼진 배경 신호를 감지한 적이 있을 것입니다.신호는 다양한 구조에 따라 강도가 다를 수 있으며 여기원의 파장에 따라 강도의 변화를 보일 가능성이 있습니다.
그러나 잘못된 염색 기법에 대한 프로토콜 및 참고 사항을 확인하기 전에, 샘플의 생물학적 구성을 고려하세요.세포로 이루어져 있습니까?색소가 포함되어 있습니까?구조 단백질이 상당량 존재합니까?해당 질문 중 하나라도 “예”라고 답한 경우, 보고 계신 신호는 생각보다 이질적이지 않을 것입니다.그러한 배경의 전부는 아니더라도 일부는 자가형광으로서 자연적으로 발산합니다.
생물학은 생각보다 밝습니다-자가형광의 정의
생물학적 구조에 의해 자연적으로 방출되는 빛인 자가형광은 세포와 조직에서 광범위하게 발생하는 현상입니다.자가형광은 형광 능력을 보여주는 내인성 분자 구성요소에 의해 발생합니다.염색제 및 형광염료에 사용되는 재조합 형광단과 마찬가지로, 자가형광 분자는 일반적으로 들어오는 광자에 의해 여기될 수 있는 비편재화된 전자를 포함한 다환식 탄화수소로 구성되어 있습니다.자가형광 분자는 들어오는 빛에 자극받은 후 효율적인 진동 이완에 대한 저항성을 보입니다.결과적으로, 과잉 에너지는 여기된 광자보다 더 적은 에너지와 더 긴 파장을 가진 새로운 광자로 방출됩니다.메커니즘은 익숙하지만, 일상에서 자가형광을 접한 적이 없는 이유에 대해 궁금해하실 수 있습니다.결국은 우리 스스로가 생물학적인 존재이기 때문입니다.그러나 우리가 쉽게 형광을 발산하지는 않습니다.
키틴과 같은 내인성 분자는 자외선 자극하에 활발하게 자가형광을 방출합니다(좌측 그림 1 참조).그러나, 많은 자가형광은 실험실에서 흔히 보이는 재조합 형광체에 비해 들어오는 광자에 의해 여기될 가능성이 낮습니다.마찬가지로, 재조합 조영제의 농도도 벤치톱 염색 프로토콜에서 조정하여 형광 신호를 제한하거나 증폭할 수 있지만, 자연적인 자가형광은 항상 생물학적 농도로 제한됩니다.
그림 1.살아 있는 표본 내 자가형광의 예시.좌측: 자외선(UV) 자극하에서 전갈의 자가형광.우측: 표피층의 자상 부위를 향해 세로로 성장하는 신생혈관을 보여주는 외상 후 10일이 경과한 래트 피부 회복 이미지.파란색(DAPI): 세포핵.오렌지색(자가형광): 피부 조직.빨간색(CD31): 혈관.Olympus BX51 광시야 형광 현미경 및 DP71 카메라를 사용하여 캡처한 이미지.이미지 제공: 중국 중의학연구원 실험연구센터, LiShuang Li.
자가형광 분자는 또한 특정한 여기 범위가 있지만, 대부분의 자가형광은 자외선부터 녹색 범위에서 여기 가능하며 상대적으로 넓은 여기 스펙트럼을 산출합니다.전용 형광 자극 광원 및 육안보다 더 민감한 광자 탐지기를 탑재한 이미징 시스템을 사용할 경우 이러한 요소들이 결합되어 자가형광을 훨씬 더 흔히 접할 수 있습니다(그림 1, 우측: 오렌지색 신호).
생명과학 연구에서 자가형광의 일반적인 원인
연구 이미징 실험에서 자가형광의 존재를 적절히 수용하려면, 샘플을 구성하는 생물학적 구성요소를 고려해야 합니다.다음은 연구자들이 실험실에서 자주 보게 되는 몇 가지 자가형광 생성 물질입니다:
1.니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(Nicotinamide adenine dinucleotide)
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 또는 NAD(P)H는 세포질 전반을 통틀어 발견되는 대사 보조인자 및 전자 운반체이며, 세포질에서 당분해 및 인산 펜토스 경로에서 중요한 구성요소로 작용합니다.세포 대사의 중요한 구성요소라는 것은 NAD(P)H 자가형광이 거의 모든 생세포 내에 존재한다는 것을 의미합니다.분자는 대사적 기능을 수행하기 위해 산화되고(NAD+) 환원된(NAD(P)H) 상태로 자연적으로 존재합니다.그러나 NAD(P)H만이 형광을 생성합니다.산화된 대응체인 NAD+는 자가형광을 생성하지 않습니다.여기: 340nm,방출: 450nm.(출처: Chance et al.1979;Georgakoudi et al.2002).
2.플라빈(Flavins)
일반적으로 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)의 형태로 발견되는 이 대사 보조효소는 TCA 회로 및 전자전달계에서 중요한 역할을 수행합니다. 활발한 대사 과정으로 자가형광 신호의 열점이 생성되는 미토콘드리아에 주로 분포되어 있습니다.일부 연구자들은 FAD가 숙신산 탈수소효소와 같이 미토콘드리아 내의 단백질 복합체에 기능적으로 결합되어 있기 때문에 플라빈의 자가 형광을 “플라보단백질 형광(flavoprotein fluorescence)”이라고 지칭하는 것을 선호합니다.NAD(P)H의 경우와는 반대로 산화된 형태의 FAD만이 형광을 생성하며, 환원된 형태는 형광을 생성하지 않습니다.여기: 380~490nm,방출: 520~560nm.(출처: Chance et al.1979;Deyl et al.1980).
3.콜라겐(Collagen)
콜라겐은 대부분의 조직에서 다양한 지지 구조 매트릭스를 만들기 위해 조립될 수 있는 핵심적인 기계적 단백질입니다.콜라겐은 피부의 진피층, 내부 장기의 세포외 기질 및 주변 혈관구조에서 접할 수 있습니다.또한 힘줄, 인대, 모발, 손톱의 구성 성분이기도 합니다.세포 배양에서는 거의 보이지 않지만, 이미징 실험에서 생체 내 샘플이나 전체 조직을 사용하는 연구자들은 콜라겐을 접할 수밖에 없을 것입니다.여기: 270nm,방출: 390nm.(출처: Georgakoudi et al.2002).
4.엘라스틴(Elastin)
다른 중요 세포외 기질(ECM) 단백질인 엘라스틴은 콜라겐과 함께 산재하여 세포외 기질의 기계적 신장성을 더 높여줍니다.엘라스틴은 혈압 변화에 대응하기 위해 탄성 변형을 자주 경험하는 혈관구조 주변에 밀집되어 있습니다.엘라스틴은 또한 피부에서도 발견되며, 피부는 그 아래의 뼈와 근육의 움직임을 보완하기 위해 유연성이 필요합니다.다시 한번 이야기하지만, 생체 내 샘플이나 전체 조직을 이미징하는 연구자들은 엘라스틴과 같은 구조 단백질에 의한 자가형광을 인지할 것입니다. 여기: 350~450nm,방출: 420~520nm.(출처: Deyl et al.1980).
5.리포푸신(Lipofuscin)
상당히 혼란스러운 자가형광 분자인 리포푸신은 신경세포, 교감신경세포, 골격근세포, 심근세포 등 형광 스펙트럼의 작지만 활발한 구조를 구성하고 있는 것을 발견할 수 있습니다.리포푸신은 세포 배양 및 전체 조직 모두에서 확인할 수 있습니다.리포푸신은 샘플이 생물학적 노화를 경험하면서 점점 더 명확하게 관찰되는 것으로 나타났습니다.이름을 보면 지질 또는 지질단백질이 원인인 것 같지만, 리포푸신의 자가형광 신호는 단백질, 탄수화물 및 지질의 융합에 기인합니다.여기: 345~490nm,방출: 460~670nm.(출처: Billinton and Knight 2001).
6.트립토판(Tryptophan)
필수 아미노산이며, 신경학 연구에서 접할 수 있는 세로토닌 및 멜라토닌과 같은 신호 분자의 필수 전구체인 트립토판은 단백질 생합성의 필수 구성요소입니다.트립토판 잔여물은 대부분의 접힌 단백질에서 발견할 수 있으며, 이후 자가형광 신호는 세포 및 조직 모두에 스며들기 때문에 트립토판이 널리 퍼져있는 것을 과소평가할 수는 없습니다.단백질 형태와 밀접히 연관된 트립토판의 구조 화학적 특성으로 인해 트립토판 자가 형광은 단백질 구조와 결합 상태의 변화에 따라 파장과 강도가 변하는 것으로 관찰되었습니다.여기: 280nm,방출: 350nm.(출처: Ghisaidoobe and Chung 2014).
7.멜라닌(Melanin)
멜라닌은 피부, 모발 및 안구의 배색에 기여하는 천연색소입니다.피부의 기저 상피 세포에서 생성되는 멜라닌은 귀중한 단백질 및 DNA가 몸 바깥을 향하는 피부 세포에서 태양의 자외선으로부터 손상되는 것을 막아주는 광보호 분자로 작용합니다.멜라닌세포를 직접적으로 배양하지 않는 한, 자연적인 농도 및 분포가 동일한 샘플 내에서도 다를 수 있기 때문에 멜라닌은 피부를 통해 이미징하는 실험에서 가장 많이 고려해야 합니다.여기: 340~400nm,방출: 360~560nm.(출처: Gallas and Eisner 1987).
샘플 전처리에서의 형광
상기 원인들은 생물학적 조직에서 광자를 자연적으로 방출합니다.많은 연구자들은 또한 실험실에서 샘플을 전처리하는 데 필요한 비생물학적 구성요소 또는 시약에서 형광을 접하게 됩니다.
예를 들어 페트리 접시, 웰플레이트 및 세포 배양 플라스크의 플라스틱 바닥은 넓은 스펙트럼으로 형광을 밝게 발산할 수 있습니다.생물학적 샘플의 형광 이미징을 수행해야 할 경우, 유리 바닥이나 구체적으로는 비형광 고분자 용기를 사용할 것을 권장합니다.세포 배양 배지에 일반적으로 첨가되는 페놀 레드 또한 생세포를 이미징할 때 배경 형광을 대폭 증가시킬 수 있습니다.이미징 실험을 시작하기 전에 페놀 레드가 없는 대안 배지로 변경하여 이를 쉽게 방지할 수 있습니다.
종이가 강한 형광성을 띠기 때문에 종이 라벨 또는 스티커도 비슷한 문제를 발생시킬 수 있습니다.종이 라벨을 용기나 슬라이드에 사용할 경우, 이미징하려는 샘플에 라벨이 방해되지 않도록 하세요.
마지막으로 알데히드 고정제는 형광 또는 염색 프로토콜에 일반적으로 사용됩니다.글루타알데히드 또는 포름알데히드와 같은 시약은 단백질과 반응하여 세포 및 조직 전체에 형광 교차결합을 만들어 냅니다.의도치 않은 형광 신호의 축적을 방지하려면 비알데히드 고정제로 교체하세요.
이러한 사례들은 자가형광이 자연적으로 발생하는 원인이 아니지만, 그들의 기원과 영향을 이해하여 이미지 데이터에 대한 원치 않는 영향을 방지할 수 있습니다.
이미징 실험에서 원치 않는 자가형광을 관리하는 방법
이제까지 몇 가지 자가형광물질 및 그것들을 찾을 수 있는 위치를 확인했습니다.이제 한 가지 질문이 떠오릅니다.이미징 실험을 시작하기 전에 이러한 신호들을 어떻게 관리할 수 있습니까?
단순 조직 또는 단세포 배양에서는 시판되는 염색제의 여기 및 방출 스펙트럼을 주의 깊게 선택하고, 그에 따라 주요한 자가형광 피크를 방지할 수 있는 좁은 필터를 찾습니다.이렇게 하면 신호 대 잡음비를 상당히 높일 수 있습니다.
프로토콜이 허용할 경우, 양자 효율이 높은 염색제를 선택하거나 조영제의 농도를 높여서 실험합니다.비록 많은 비용이 들지만, 이 또한 신호를 증폭할 수 있습니다.현대 전략에서는 자주 접하는 자가형광의 여기 및 방출 범위를 피하기 위해 700nm 이상의 여기되는 라벨(예: Cy7 또는 Alexa Fluor 750)이 있는 근적외선(NIR) 여기광을 사용합니다(그림 2).
그림 2.생물학적 이미징에서 일반적으로 볼 수 있는 자가형광 분자에 관련한 Alexa 시판 형광단의 방출 피크.NIR 범위에서 여기 및 방출하는 조영제를 선택하여 자가형광 기여 물질이 원치 않게 방출되는 것을 방지할 수 있습니다.
이렇게 유연하게 선택할 수 있는 경우, 대안 이미징 기법이 실험에 적합한지 조사하세요.두꺼운 샘플 또는 조직의 경우, 공초점 또는 다광자 현미경 시스템이 전반적인 자가형광 기여도를 최소화할 수 있습니다.각각 초점 외 빛이 수집되지 않게 하거나 초점면에 대한 여기를 제한하여 이를 수행합니다.
생물발광 이미징과 같은 기술은 자가형광이 수집 데이터에 신호를 더할 가능성을 완전히 제거합니다.발광 실험에서는 방출 광자를 생성하기 위해 화학 발광 반응에서 여기광이 필요하지 않기 때문에 자가형광이 자극되지 않습니다.
이미징 전에 자가형광 신호 기여도를 줄일 수 없는 경우, 스펙트럼 분리 또는 배경 제거와 같은 촬영 후 이미지 처리 기술이 효과적인 대안일 수 있습니다.이러한 컴퓨터 기술을 사용하기 위해서는 연구자들이 샘플에서 내인성 형광단을 가려내거나 자가형광 스펙트럼에 대한 사전 지식을 갖추어 신호에 대한 기여도를 제거해야 합니다.
