연구소가 실험실 이용 시간을 제한하고 사회적 거리두기를 실천하며 직원의 안전을 도모함에 따라 살아 있는 세포를 통해 작업을 자동화하고 간소화하는 능력을 갖추는 것이 생산성 유지를 위해 그 어느 때보다 더 중요합니다.
하지만 장비를 최적화하고 실험실 재출입을 요구할 수 있는 예상치 못한 시나리오를 피하려면 유념해야 할 여러 고려 사항이 있습니다.
다음은 고려해야 할 4가지 팁입니다.
1. 샘플을 따뜻하고 안전한 환경에 건강하게 유지합니다.
살아 있는 세포 이미징 중 가장 큰 문제의 하나는 따뜻하고 편안한 배양기 밖의 현미경 스테이지에서 정상적으로 행동하도록 샘플을 건강하게 유지하는 방법입니다.
이 문제가 어려울 수 있지만 세포를 위한 안정된 온도, 습도 및 CO2 밀도를 제공할 수 있는 현미경 전용 스테이지 상단 배양기 또는 폐쇄형 배양기를 사용하여 최대한 편안하게 샘플을 유지할 수 있습니다.
차가운 접촉으로 인해 샘플의 건강에 흔히 해가 될 수 있는 대물렌즈를 가열하는 것을 잊지 마십시오.
또한, 마이클로플레이트의 주변 영역이 중심 영역보다 더 환경 변동 위험이 높을 수 있으므로 안정성을 높이기 위해 중심 웰들을 사용하고 가장자리 웰들을 피해야 합니다. 예를 들어 96웰 플레이트(12×8웰)를 사용하는 경우 실험에는 중심 60웰(10×6웰)만을 사용해야 합니다.
그림 1. 스테이지-상단 배양기.
2. 안정된 환경 온도를 생성하여 초점을 향상시킵니다.
고려해야 할 또 하나의 요소는 실내 온도입니다. 작은 변화가 이미징 성능에 영향을 미칠 수 있습니다.
살아 있는 세포의 고배율 관찰에 현미경의 환경 온도 안정성이 특히 중요합니다. 높은 개구수 관찰은 시야 심도가 얕기 때문에 온도 변화에 의해 야기된 작은 Z 편차에도 초점을 상실할 수 있습니다.
환경을 최적화하려면 실험을 시작하기 전에 에어컨을 작동시키고 실내 온도를 안정되게 해야 합니다. 또한 안정성을 향상시키려면 에어컨에서 현미경으로 직접적인 공기 흐름을 피합니다.
3. 초점 및 보정환을 정밀하게 설정하여 이미지 품질을 높입니다.
Z-드리프트같은 시간 변동을 처리하는 또 하나의 방법은 초점 및 보정환을 통한 보정을 최대한 정밀하게 설정하여 살아 있는 세포 실험을 시작하는 것입니다.
연구원들은 신중하게 초점을 조정하지만 보정환에 대해 종종 잊어버립니다. 하지만 보정환는 심층 조직 관찰이나 개구수가 높은 대물렌즈 사용 시에 특히 이미지 품질을 크게 향상시킬 수 있습니다 .
보정환의 이상적인 위치는 샘플의 굴절률, 관찰 평면의 심도 및 커버 유리의 두께 등 여러 요소에 좌우됩니다. 대부분의 유리 커버슬립 및 유리 바닥 접시의 두께는 170µm(#1.5)이지만 변동될 수 있으며, 더 중요한 것은 플라스틱 용기로 이들 값을 추정할 수 없다는 것입니다.
이 때문에 플라스틱 마이크로플레이트 또는 접시 사용 시에 특히 이미지 대비를 확인하여 항상 보정환을 정밀하게 조정합니다.
일반적으로 보정환 보정은 현장에서 실시되어야 합니다. 다광자 현미경을 사용한 심층 관찰 같이 적극적인 보정환 보정 조정이 필요한 실험의 경우 이것은 실험실 내에서 더 많은 시간을 보내야 함을 의미할 수 있습니다. 다행스러운 점은 전동식 보정환으로 이러한 조정을 자동화할 수 있다는 것입니다.
그림 2. 커버 유리 두께 표시기가 있는 대물렌즈의 보정환.
심층 이미징을 위한 전동식 렌즈 시스템에 대한 자세한 내용은 다음 블로그 게시물을 참조하십시오. 다광자 현미경의 심층 이미징을 향상시키는 방법
4. 전용 초점 조정 모듈을 사용하여 샘플을 초점이 맞게 유지합니다.
하지만 Z 편차가 발생하면 어떻게 될까요?
위의 모든 조치를 취해도 이미지가 항상 초점이 맞는 것은 아닙니다. 결국, 여러 요소가 Z 편차를 야기할 수 있습니다. 이것은 누군가 실내로 걸어들어 오면서 생기는 물리적 진동이나 환경 온도 변화 외에 시약 추가 같은 적극적이고 의도적인 변화에 의해 야기될 수 있습니다.
대부분의 전동식 현미경이 이미지 대비 기반 자동초점 기능을 포함하고 있지만 다음과 같은 한계도 있습니다.
- 조정 기능의 제한된 범위
- 대비 기반 초점 조정을 위한 여기광은 광독성을 야기합니다
살아 있는 세포 실험 중 초점을 보장하는 한 가지 방법은 TruFocus 근적외선(NIR) 레이저 기반 Z-드리프트보상기 같은 전용 초점 모듈을 사용하는 것입니다. 또한 근적외선은 지연된 관찰 중 이미징 파장에 대한 광독성 및 누화를 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
모듈의 원샷 자동초점(AF) 모드가 불필요한 조명을 방지하지만 라이브 관찰이나 빠른 현상의 연속 이미지 획득에 연속 AF 모드가 사용될 수 있습니다.
그림 3. Olympus TruFocus Z-드리프트보상기를 사용하여 샘플의 초점을 선명하게 유지합니다.
아래 간단한 동영상을 시청하여 Z-드리프트보상기가 장기적인 이미징을 위해 작동하는 방법을 확인할 수 있습니다.
살아 있는 세포에 대한 효율적 실험을 수행하여 생산성 유지
항상 해야 할 작업이 있습니다. 이러한 팁이 생산성 유지, 오래 살아 있는 세포 이미징 달성 및 연구 계속 수행에 도움이 되기를 바랍니다. 실험실 자동화 방법에 대해 궁금한 점이 있으면 언제라도 문의하십시오!
