매년 Nature Methods는 전년도에 생명 과학 산업을 발전시킨 기술과 접근법을 검토하고 가장 인기 있고 영향력인 큰 기술과 접근법을 선정합니다. 2017년 Nature Methods는 오가노이드를 올해의 기술(Method of the Year)로 선정했습니다. 그 이후, 많은 연구자들의 끊임 없는 노력 덕분에 오가노이드에 대한 연구는 많은 결실을 맺었습니다.
간단히 말하자면, 오가노이드는 조직 또는 줄기 세포에서 추출할 수 있는 3차원(3D) 조직 배양체입니다. 오가노이드는 기본적으로 인간의 조직이나 장기의 간소화된 축소판이기 때문에 광범위한 연구에서 사용됩니다. 오가노이드는 제자리 조직의 생리학적 구조와 기능을 모방하고 수많은 계대배양을 거쳐 안정적으로 유전적 정보를 유지할 수 있습니다.
인체 조직을 복제할 수 있는 오가노이드를 다음과 같은 목적으로 사용할 수 있습니다.
- 장기 발달 프로세스에 대한 인사이트 확보
- 약물의 기능 시험
- 재생 치료 개발
이 게시물에서는 최신 오가노이드 연구에 대해 알아보고 현미경 이미징 시스템이 중요한 연구 작업을 어떻게 진전시키고 있는지 살펴보겠습니다.
오가노이드 연구의 발전
연구자들을 오가노이드를 사용한 새로운 연구를 지속적으로 수행하고 있습니다. 주목할 만한 연구 몇 가지는 다음과 같습니다.
1. 환자 유래 교모세포종 오가노이드 모델 및 바이오뱅크의 종양간 및 종양내 이질성 재구성
2019년 펜실베니아 대학교 연구진은 Cell에 “환자 유래 교모세포종 오가노이드 모델 및 바이오뱅크의 종양간 및 종양내 이질성 재구성(A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity)”라는 제목의 논문을 게재했습니다. 이 논문은 환자 유래 교모세포종 오가노이드(glioblastoma organoid, GBO) 모델과 바이오뱅크를 만들었다고 보고했습니다.
이 연구는 GBO가 교모세포종의 주요 특성을 보유하고, 환자를 위한 치료 전략 개발에 즉시 사용될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 연구진이 만든 바이오뱅크는 교모세포종에 대한 기초 연구와 중개 연구에 대한 풍부한 리소스를 제공합니다.
연구자들은 현미경 관찰을 통해 오가노이드의 증식 프로세스와 형태적 변화를 문서화했습니다. 이들은 또한 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 오가노이드의 일부 단백질 표지자의 패턴을 관찰했습니다.
이 연구는 오가노이드의 형태 및 특징 측면에서 명백한 이질성과 세포 구성 측면에서 모종양과의 높은 유사성을 입증했습니다.
2. 인간 전뇌 발달 모델을 통해 확인한 염색질 접근성 역학
2020년 Science에 “인간 전뇌 발달 모델을 통해 확인한 염색질 접근성 역학("Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development)”이라는 논문이 게재되었습니다. 이 논문에서 연구자들은 인간 전뇌 오가노이드를 만들기 위한 배양 프로세스와 그 용도를 설명했습니다. 이들은 인간 전뇌 오가노이드가 어떻게 전뇌의 여러 부분으로 자기조립되는지 보여주었습니다.
더 흥미로운 것은, 연구자들이 인간 전뇌 오가노이드의 수명을 최대 300일 연장하는 방법을 발견했다는 점입니다. 이는 전뇌 오가노이드가 더 복잡한 구조물로 발달해가는 과정을 관찰하기에 충분한 시간입니다.
3. 뇌종양 및 신경학적 결손을 촉진하는 인간 중간뉴런 전구체의 증폭
2022년 Science에 “뇌종양 및 신경학적 결손을 촉진하는 인간 중간뉴런 전구체의 증폭(Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects)”이라는 논문이 게재되었습니다. 이 연구는 대뇌피질 발달 기형(malformations of cortical development, MCD)의 원인이 되는 특정 인간 발달 프로세스를 밝혀냈습니다. MCD는 아동의 발달 지연과 뇌전증을 유발할 가능성이 있습니다.
연구진은 복합결절성경화증(tuberous sclerosis complex, TSC)에 대한 인간 두뇌 오가노이드 모델을 만들고 CLIP(caudal late interneuron progenitor)이라는 특정 신경 줄기 세포 유형을 찾아냈습니다. TSC가 있는 경우, CLIP 세포가 과다 증식하여 과도하게 중간뉴런, 뇌종양 및 대뇌피질 기형을 유발합니다.
오가노이드는 발달, 질병, 약물에 대한 연구에 유망한 모델입니다. 또한 재생의료와 같은 다른 분야에서도 널리 활용될 수 있는 잠재력이 있습니다. 그러나 오가노이드의 배양 조건과 구조는 부착 세포(attached cell)보다 더 복잡하므로 오가노이드 배양, 관찰 그리고 오가노이드에 대한 정량적 데이터 분석을 수행하는 데 여전히 많은 어려움이 있습니다.
현미경 이미징이 오가노이드 연구를 발전시키는 3가지 방식
다행히, 현미경 이미징 장비는 이러한 어려움을 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 현미경 이미징 시스템과 소프트웨어는 다음과 같은 3가지 방식으로 오가노이드 연구를 발전시키고 있습니다.
1. 오가노이드 배양체 품질 관리
일반적으로 오가노이드를 준비하는 방법은 배아 세포 또는 유도 만능 줄기 세포를 분리한 다음 이 세포들을 (Matrigel과 같은) 지지 배지에서 배양하여 3차원 증식을 지원하는 것입니다.
오가노이드 형성에 관여하는 특정 신호 전달 경로를 활성화하거나 억제하기 위해 이 배지에 사이토카인, 성장 인자 및 저분자를 첨가합니다. 신호 전달 경로는 체내의 동등한 장기의 항상성을 달성하고 유지하는 일을 중개하는 경로와 같습니다.
도쿄의치과대학 연구소의 Takanori Takebe 박사의 연구에 따르면, 오가노이드로의 후속 분화 효율성은 유지 배양 동안, 증식 초기 단계에서의 차이로부터 크게 영향을 받습니다. 그는 분화 가능한 iPS 세포주에서는 증식 초기 단계에서 계대 배양 후 고착된 대부분의 단일 세포에서 세포 군집이 형성되는 것을 발견했습니다.
Takebe 박사는 분화 내성 iPS 세포주의 유지 배양 초기 단계에서 더 높은 빈도의 세포사가 더 낮은 수의 iPS 세포 군집 형성을 유발하고, 이로 인해 궁극적으로 간 싹(live bud) 오가노이드로의 분화 효율성이 줄어든다는 가설을 세웠습니다. 그러므로, 오가노이드의 재현 가능한 형성을 위해서는 오가노이드 분화를 위한 더욱 최적화된 프로토콜 개발과 원래의 미분화 iPS 세포 배양 최적화가 필요합니다. 새로운 인사이트를 얻고 실험 프로토콜을 향상하기 위해 Takebe 박사는 Evident의 배양 모니터링 시스템을 사용합니다.
배양된 샘플의 타임랩스 데이터 획득 및 분석을 위해 CM30 시스템을 사용함으로써, 연구자는 세포 배양 동안 iPS 세포의 상태를 이해하고 분화 효율성을 높여 실험 프로토콜을 더욱 개선하기 위한 주요 요인을 찾아낼 수 있습니다.
오가노이드는 배양 시간이 길고 증식에 필요한 배지 및 첨가제의 비용이 높기 때문에 연구자들은 오가노이드 배양 및 증식 프로세스에 특별한 주의를 기울이고 오염을 피해야 합니다.
CM30 시스템의 원격 모니터링 기능 덕분에 현미경 검사를 위해 인큐베이터에서 표본을 제거할 때 클린룸에 들어갈 필요가 없습니다. 따라서 실험 효율성이 크게 향상되고 오염의 위험이 줄어듭니다.
인큐베이터 내 오가노이드 개발. CM 배양 모니터링 시스템을 사용하여 캡처한 이미지. 이미지 데이터 제공: ACEL, Inc.
2. 오가노이드 현미경 이미징
오가노이드는 어느 정도 부피가 있는 3D 세포 배양체이므로 3D 이미징을 위한 다층 Z축 이미지 정보를 획득할 수 있는 현미경 이미징 장치가 권장됩니다. 이러한 기능을 활용하면 이미징할 때 오가노이드의 형태학적 특징과 내부 세포 구조에 대한 완전한 정보를 얻을 수 있습니다.
오가노이드 이미징을 위한 레이저 스캐닝 컨포컬 현미경
레이저 스캐닝 컨포컬 현미경은 오가노이드의 3D 체적 이미지를 획득하는 데 적합합니다. 초점이 맞지 않은 배경을 가리는 검출기 앞의 핀홀은 높은 축 해상도로 관심 깊이에 있는 정보만 캡처할 수 있습니다.
Evident의 FLUOVIEW™ FV4000 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경은 Evident의 SilVIR™ 검출기를 사용하여 정밀 이미징을 지원합니다. 이 검출기는 높은 신호 대 잡음비, 더 정확한 이미징, 높은 공간 및 스펙트럼 해상도를 지원합니다. SilVIR 검출기는 Evident의 특허받은* 기술을 사용하여 정밀 3D 이미징 데이터를 얻기 위한 높은 동적 범위 광자 계수를 제공합니다. 이 기술은 또한 정밀 3D 이미지의 재구성을 가능하게 하며 오가노이드 구조를 조사할 때 이상적인 기능입니다.
*특허 번호 US11237047.
또한 FV4000 시스템은 검증된 근적외선(NIR) 솔루션을 제공합니다. NIR 이미징은 깊은 침투, 낮은 광독성, 낮은 조직 자가형광 간섭을 지원합니다. 따라서 이 시스템은 가시광 범위에서 다양한 형광 대비로 작동하여 혼선 없이 오가노이드 다색 형광 이미징을 수행할 수 있으며, 오가노이드 활동을 장시간 모니터링할 수 있습니다.
FLUOVIEW 컨포컬 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 21일간 연속 관찰한 3D 배양 세포 구체. 핵은 SYTOX Orange(빨간색)로 표지되었습니다. 세포골격은 Alexa Fluor 488(녹색)로 표지되었습니다.
오가노이드 이미징을 위한 다광자 현미경 검사
부피가 큰 오가노이드에 대한 완전한 이미지를 획득하는 경우 이미징 깊이에 대한 요구가 더 엄격해집니다. 다광자 현미경은 오가노이드에 대한 심층 이미징에 적합한 현미경 이미징 시스템입니다.
이 시스템이 오가노이드에 대한 심층 이미징을 지원하는 방법을 개괄적으로 설명하면 다음과 같습니다.
Evident의 FV4000MPE 다광자 현미경은 첨단 광학 설계로 심층 이미징의 감도와 해상도를 최적화합니다. 400~1600nm의 파장 범위는 가시광 파장 검출 역량을 저해하지 않고 IR 여기 효율성을 향상합니다.
크고 투명한 조리개가 있고 효율성이 뛰어난 검출 광학 경로는 더 많은 방출 신호, 특히 큰 입사각에서 산란 광자의 수집을 지원합니다. 또한 시스템의 핵심 부분에 위치한 SilVIR 검출기는 가시광부터 근적외선 파장 범위까지 매우 낮은 잡음과 높은 감도를 제공하여 높은 신호 대 잡음비를 달성합니다.
이러한 광학 기능을 통해 오가노이드 내부 깊은 곳에서 정보를 캡처할 수 있습니다. TruResolution™ 대물렌즈는 자동 구면수차 보정을 통해 심층 이미징의 밝기와 해상도를 향상합니다. 이러한 고성능 광학 기능으로 모든 수준에서 캡처할 3D 이미지에 대한 상세한 정보를 얻을 수 있습니다.
오가노이드 이미징을 위한 초고해상도 현미경 검사
부피가 큰 오가노이드의 경우 이미징 시스템에 대한 요구 사항이 훨씬 더 많습니다. 이미징 시스템은 Z 스택 이미지를 획득하고 획득한 이미지를 절단해야 하는데 이를 위해서는 고속 이미징 획득이 필요합니다. 이러한 경우 스피닝 디스크 컨포컬 현미경 검사가 유용합니다.
레이저 스캐닝 현미경은 하나의 핀홀을 사용하지만, 스피닝 디스크 컨포컬 현미경은 고속으로 회전하는 수백 개의 핀홀이 있는 불투명한 디스크를 사용합니다. 샘플 전체를 지점별로 촬영하지 않고 한 번에 촬영하므로 이미징 속도를 상당히 향상하고 광손상을 줄일 수 있습니다.
Evident의 IXplore™ SpinSR 초고해상도 현미경은 빠른 이미징, 높은 감도, 낮은 광독성 및 120nm까지의 미세한 해상도를 갖춘 확장 가능한 초고해상도 모듈을 제공합니다. 이러한 기능은 오가노이드에 대한 빠른 Z 스택 이미징 및 이미지 절단을 지원합니다.
IXplore SpinSR 시스템은 또한 Evident의 실리콘 오일 대물렌즈 시리즈와 함께 사용할 수 있습니다. 이 광학 장치는 오가노이드에 대한 심층 이미징을 수행할 때도 블러를 줄이면서 선명한 초고해상도 이미지를 가능하게 합니다.
Evident의 실리콘 오일 대물렌즈는 굴절률이 1.40인 특수 실리콘 오일을 이멀젼 매체로 사용합니다. 이 수치는 고해상도 이미지(워터 이멀젼 대물렌즈보다 높음)를 획득하고 오가노이드와 기타 두꺼운 표본 등 크게 산란을 유발하는 표본을 관찰할 때 요구되는 조건을 충족합니다.
3. 오가노이드 이미지에 대한 정량 분석
지금까지 레이저 스캐닝 컨포컬, 다광자 및 초고해상도 현미경과 같은 하이엔드 현미경 이미징 장비로 오가노이드에 대한 선명한 거시 및 미시 이미지를 획득하는 방법을 알아봤습니다. 이러한 이미지로 연구자는 3D 표본 내의 각 세포의 미세 구조를 관찰하거나 나아가 세포 이하 수준까지도 확인할 수 있습니다.
그러나 생명 과학 연구에서는 표본의 세부 이미지를 관찰하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 효능 검증을 위한 오가노이드 모델을 사용한 실험과 약물 독성학 분석의 경우, 오가노이드 및 그 내부 세포의 형태에 대한 정량적, 정성적 분석도 필요합니다. 예를 들어, 멀티웰 플레이트를 사용하여 다양한 약물 용량 농도에서 여러 오가노이드의 차이를 비교하면 더욱 신뢰할 수 있는 통계 데이터를 얻을 수 있습니다.
이러한 응용 분야의 요구 사항을 충족하기 위해 Evident는 멀티웰 플레이트에서 배양된 세포 스페로이드 또는 오가노이드 등의 표본으로 복잡한 3D 세포 식별 및 분석을 수행하는 NoviSight™ 세포 분석 소프트웨어를 개발했습니다.
오가노이드 연구에 도움을 주는 이 소프트웨어의 몇 가지 특징을 다음과 같습니다.
- 고유한 True 3D 세포 분석 기술은 샘플의 공간적 형태를 사실적으로 재현하도록 지원
- 다중 매개변수 측정 모듈은 오가노이드 및 세포 구성 요소를 신속하게 식별하고, 부피, 표면 면적, 공간 거리 및 형광 강도 등의 유용한 데이터를 얻을 수 있도록 지원
- 대화형 사용자 인터페이스로 세포 이미지와 해당 통계를 쉽게 연결시킬 수 있으므로 데이터에 대한 정확한 통계 분석 지원
오가노이드는 유전적 수준과 형태학적 수준에서 해당 인체 조직을 매우 유사하게 모방하는 데 사용할 수 있으므로 발달 과정, 질병 연구, 임상 면역, 종양의 약물 민감성, 재생의료 및 정밀의료와 같은 응용 분야에서 폭넓은 시뮬레이션 잠재력을 갖고 있습니다.
그렇지만, 오가노이드는 아직 신생 기술이라는 점을 기억해야 합니다. 오가노이드는 배양, 품질 관리, 실험 재현성 측면에서 한계점이 존재합니다. 오가노이드에 대한 기초 연구, 응용 및 중개 활동은 아직 갈 길이 멉니다.
광학 및 현미경 분야에서 풍부한 역사를 기록해온 Evident는 실험 프로세스 내내 오가노이드 연구자를 지원하고자 합니다. Evident는 샘플 준비부터 3D 데이터 획득 및 분석에 이르기까지 오가노이드 연구를 위한 완전한 솔루션을 제공함으로써 더 건강하고 안전한 세상을 만든다는 사명을 실천하고 있습니다.
