공초점 현미경 검사를 통한 당뇨병 대처

적요

진성 당뇨병의 전 세계적 과제를 해결하기 위한 연구 노력은 첨단 현미경 기술 이용에 크게 좌우되지만 종종 많은 연구원들이 해당 장비에 접근할 수 없습니다. 생명과학 연구 그룹의 일상적 요구에 부응하는 새로운 범주의 간편한 일체형 컨포칼 현미경이 시판됨에 따라 학생과 교수들이 모두 고품질 결과를 달성할 수 있습니다.  

Olympus의 FluoView FV10i는 Rostock 대학 의학학부 Simone Baltrusch 교수의 연구 그룹에 유용한 도구로 사용되고 있습니다. Olympus의 애플리케이션 전문가인 Dr. Helge Schmidt와 회동한 후 Baltrusch 교수는 컨포칼 현미경에 대해 이용 가능한 옵션이 미토콘드리아 네트워크의 역할에 대한 이해 증진 및 신경장애 진단 기법의 개발 촉진을 비롯하여 연구 그룹의 작업에 어떤 도움을 주었는지에 대해 논의합니다.

현재 추세가 계속될 경우 2035년에는 성인 10명 중 1명이 날이 갈수록 긴급한 의료 과제가 되고 있는 진성 당뇨병을 앓게 될 것입니다.¹

 팀
Olympus FluoView FV10i를 사용하는 실험실의 Dr Simone Baltrusch 교수(뒷줄 중앙) 및 연구 그룹의 일원들(뒤 좌측에서 앞 우측: Rica Waterstradt, Dr. Julia Schultz, Annett Kott, Janine Leckelt, Jan Niemann)

이 대사 장애의 기본적인 주요 인자 중 하나는 췌장의 인슐린 생성 β-세포의 기능 손상입니다. 이와 함께 인슐린 분비가 후속적으로 감소되어 혈당 수치가 비정상적으로 증가하고 다양한 생리학적 합병증이 초래됩니다. 유형 1 당뇨병이 β-세포의 자가면역 파괴에서 비롯되는 반면, 유형 2 당뇨병은 신체 주위 조직 내 β-세포 기능 상실 및 인슐린 저항이 특징입니다. 이러한 복합 질환의 메커니즘 및 영향을 이해하는 것이 매우 중요하며 Rostock 대학 의학학부의 Simone Baltrusch 교수는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 이를 위한 이상적인 도구로 간주하였습니다.

표준 광시야 현미경 사용과 비교하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경은 정의된 초점면에서만 추출된 선명한 이미지를 제공합니다. 컨포칼 기술이 발전함에 따라, 다광자 기술 기반의 경우 같은 복잡한 모듈러 시스템이 체내 연구의 최첨단을 제공한 반면, 분주한 생명과학 연구 실험실의 일상적 요구를 처리하기 위한 새로운 범주의 간편한 일체형 시스템도 출현한 것이 흥미로운 일이었습니다. Simone Baltrusch 교수의 그룹 내 모든 구성원이 컨포칼 현미경의 이점을 누릴 수 있게 하는 한 가지 해당 시스템이 Olympus의 FluoView FV10i입니다. Baltrusch 교수는 “FV10i를 선택한 이유는 모든 사람들이 현미경 사용에 익숙한 것은 아니기 때문입니다. 작업이 간편한 시스템이 필요했는데 이 시스템이 바로 그 요구에 부합했습니다”라고 말하며 다음과 같이 덧붙였습니다. “연구 그룹에는 의학 논문을 작성하고 있는 학생들이 많이 있습니다. 그들은 혼자서 이 기계로 샘플을 분석하는 데 빠르게 적응하고 있으며 이는 과거에 없었던 일입니다” 한편으로 이것이 중요한 이유는 연구 그룹 내 두 명의 박사 후 연구원이 많은 학생들을 지도하고 있는 상황이기 때문입니다. 가르치는 일과 연구 사이에서 새 학생들을 지도할 시간이 제약될 수 있습니다. 그러므로 사용자 친화적인 시스템에서는 무슨 일이 일어나는 경우 감독자가 전면에 나서지 않으면서도 학생들이 스스로 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
Baltrusch 교수의 그룹은 이 시스템에 의존하여 분자 수준²에서 뿐 아니라 해당 세포기관 및 세포와 관련하여 질병의 광범위한 측면도 포함한 당뇨병의 다양한 측면을 연구합니다. Baltrusch 교수는 당뇨병의 기초를 이루는 미토콘드리아 돌연변이의 역할에 대한 이해와 눈 내의 신경세포 네트워크에 과혈당증으로 유발된 손상 정량화 등 두 가지 흥미로운 프로젝트에 대해 논의합니다.

교과서 업데이트: 당뇨 미토콘드리아 네트워크

생물학적 시스템의 지식이 발전됨에 따라 한때 정적 구성요소로 간주된 것이 대신에 고도로 상호연결된 네트워크라는 것이 갈수록 분명해지고 있습니다. 이것은 미토콘드리아에 대해서도 사실입니다. Baltrusch 교수는 다음과 같이 설명합니다. “세포 내 미토콘드리아의 교과서 그림은 종종 세포당 아마도 10-20으로 분리된 세포기관을 보여주지만, 이는 사실이 아닙니다. 이것은 합성과 분열의 연속 과정을 겪는 동적 네트워크입니다. 항상 변하는 것이죠.”

흥미롭게도 유형 2 당뇨병과 미토콘드리아 돌연변이 증가 간의 상호관계가 관찰되었습니다. 미토콘드리아 돌연변이 및 야생형 핵을 지닌 콘플라스틱(conplastic) 쥐 모델이 이러한 관계를 이해하는 데 이상적입니다.³
Baltrusch 교수는 “시간의 흐름에 따라 이러한 돌연변이가 누적될 때 어떤 일이 발생하는지 알고 싶습니다”라고 말합니다. “미토콘드리아 네트워크 구조나 기능이 변합니까? 이러한 돌연변이를 지닌 쥐를 연구하면 야생형 균주와 비교하여 어떤 일이 일어나는지 확인할 수 있습니다.”

당뇨병 모델 개발

당뇨병에 대한 초점은 Markus Tiedge 교수의 연구 그룹*을 포함한 제휴 하에서 Rostock 대학의 노화 및 질병에 대한 대규모 연구 초점의 일부이기도 합니다. 당뇨 쥐 모델 개발은 이러한 맥락에서 중요합니다. Baltrusch 교수는 노화에 관한 가장 최근 연구에서 벌레를 사용하고 있다고 설명합니다. “이것은 훨씬 더 쉽습니다. 수명이 30일인 경우 새 균주가 33일을 생존하면 수명이 더 긴 것으로 결론을 내릴 수 있지만, 이것을 사람에게 적용하는 것은 어렵습니다.” 당뇨병 관련 미토콘드리아 돌연변이 및 신경세포 손상 연구의 경우 포유류 모델이 더 정확히 인간을 대표합니다.

Janine Leckelt 연구원은 Rostock 대학에서 연구 그룹의 당뇨병 쥐 모델을 연구 대상으로 삼고 있습니다.  

그림 1은 컨포칼 현미경을 사용하여 체외 배양 및 시각화된 1차 쥐의 간세포를 보여줍니다. 이미지 처리 후, 비정상적으로 연장되거나 분열된 경우를 검출하기 위해 개별 미토콘드리아를 분화시키거나 정량화할 수 있었습니다. 획득된 이미지의 품질이 이러한 수준의 분석에 중심을 이루었으며 Olympus FV10i가 연구소 내에서 인기가 있음이 증명되었습니다. “이 프로젝트에서 FV10i를 처음 사용하기 시작했을 때 대학에서는 이곳 내부 연구소의 일부 결과를 보여주었습니다. 설명을 들은 사람들이 매우 감명을 받았으며 컨포칼 현미경을 가지고 있는 이웃 연구 그룹들 중 많은 사람들이 우리에게 다가와 이 기계를 사용할 수 있는지 물었습니다. 예약 계획을 보시면 알겠지만 예약이 완전히 꽉 찼습니다. 밤사이에 가동하는 경우에도 예약이 완전히 마감되었습니다”

그림 1: 살아있는 쥐 간세포 내 미토콘드리아 네트워크.
 A) 원래 이미지. B) 그 다음의 가장자리 검출 처리(Image J software, NIH). C) 개별 미토콘드리아(Autoquant software, Media Cybernetics) D) 연장된 미토콘드리아(흰색) 및 분열된 미토콘드리아(자주색 및 주황색). Olympus FV10i, 60x 오일 대물렌즈 사용. 기준자 10μm.

당뇨병 내에서 관찰된 미토콘드리아 분열 증가는 세포를 위한 충분한 에너지를 얻는 데 문제가 있게 된다는 것과 골격근의 인슐린 저항에 원인이 있음을 의미합니다.⁴ 반면에 매우 연장된 미토콘드리아도 문제가 있습니다. 흥미롭게도 Baltrusch의 연구 그룹은 다른 네트워크로부터의 이미지 연구가 세포 유형 및 생리학적 조건에 크게 좌우되는 것을 발견하였습니다. “미토콘드리아 네트워크는 필요한 것과 에너지를 사용할 수 있는 정도 및 이러한 것이 나오는 원천(지방 또는 탄수화물)에 적응합니다. 이들은 각기 네트워크에 영향을 미칩니다. 우리는 정말로 많은 것을 배웠습니다.”

당뇨신경병의 비침습 검출을 향해

당뇨병의 기본 메커니즘을 이해하는 것이 새 치료제를 개발하고 생물학적 시스템의 지식을 촉진하는 데 필수적이지만, 당뇨병이 삶의 질에 미치는 영향을 살펴보는 것이 똑같이 중요합니다.

Olympus FV10i 활용 2차 프로젝트는 당뇨신경병 또는 신경세포 손상의 조기 검출을 위한 새로운 기법의 개발을 향해 진행됩니다. 과혈당증(혈당수치 증가)이 5년 이상 지속될 경우 생리학적 손상이 꽤 광범위할 수 있으며 신경장애는 당뇨병의 가장 일반적인 장기적 합병증입니다. 혈액 단백질의 당화로 인해 경과된 무효소 당화 말단(AGE) 산물로 알려진 것이 생성되면 이 증상이 발생합니다. 이 산물은 신경세포의 표면에 수용체를 결합시키고 세포자멸 같은 과정을 촉발시킵니다.

따라서 조기 진단이 질병 관리에 매우 중요하지만 현재 기법은 발에 적용된 감각 트리거에 대해 환자가 전달하는 구두 반응에 따라 달라지므로 정량화할 수 없습니다 따라서 더욱 정량적인 기법이 필요하며 피부조직검사에서 신경세포 네트워크를 분석할 경우 손실된 섬유를 식별할 수 있지만 이는 고통스러우며 상처 치유도 당뇨병 환자의 문제입니다. 대신에 Oliver Stachs 교수의 안과학과** 연구 그룹과의 협력 프로젝트는 눈의 각막 내 신경세포 네트워크 분석에 초점을 맞추고 있습니다. 이 팀은 특별히 설계된 각막 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 인간 각막의 하위기저 신경총을 시각화할 수 있습니다.⁵

이러한 비침습적 방법은 당뇨신경병의 검출에 도움이 되며, 각막 신경의 구조에 대한 더 많은 이해를 통해 이 프로젝트는 클리닉 내 정량 기법으로서의 용도를 개발하는 데 주력합니다.
Baltrusch 교수의 연구 그룹에서 당뇨 쥐 모델을 연구 대상으로 삼고 Olympus FV10i를 적용하여 체외 고립된 각막 내 신경 밀도 및 길이를 정량화하고 당뇨신경병에 대한 통찰력을 제공하며 체내 각막 컨포칼 현미경의 가장 효과적인 사용을 유도합니다.

당뇨 쥐 모델

자가면역에 의해 촉발되지 않은 유형의 당뇨병에 초점을 맞추고, 특히 췌장도 세포의 s-세포는 복합 스트렙토조토신을 사용하여 파괴됩니다. 샘플은 인슐린용 항체 염색을 사용하여 조사되고 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화되며, 그림 2A는 고정된 췌장 부분 내의 온전한 췌장도를 보여줍니다. 이 모양은 그림 2B에 표시된 바와 같이 쥐 췌장의 교원질 분해 효소 소화에 의해 고립된 살아있는 췌장도와 비슷합니다.

그림 2: 쥐의 췌장도 세포 연구.
인슐린 생성 β-세포는 랑게르한스의 이 췌장도 내에서 조사되었으며 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. A) 인슐린(빨간색)용 췌장 부분 염색, 청록색으로 착색된 핵. B) 배양 내 췌장도 세포, 인슐린(녹색) 및 파란색으로 착색된 핵. Olympus FV10i 및 60x 오일 대물렌즈 사용, 기준자 50μm.

올바른 신경 찾기

노란색 형광 단백질로 표지된 신경 섬유를 가진 유전자 이식 쥐(thy1-YFP 쥐)를 사용하여 Olympus Fv10i를 통해 체외에서 각막 신경을 시각화합니다. 그림 3은 큰 기질 신경 및 하위기저 신경총의 매우 얇은 신경을 보여줍니다. 하지만 각막의 세포 아키텍처는 복잡합니다.6 그림 4에서 볼 수 있듯이, 이 신경총은 보우만 레이어에 가까이 있고 관통 A 델타신경섬유에서 발생하며 하위기저 방향을 가집니다. Baltrusch 교수는 다음과 같이 언급합니다. “하위기저 신경은 손상에 매우 민감합니다. 당뇨병에 걸린 사람과 동물에서 이러한 신경이 손실됩니다.” 기존 기법과 신규 기법을 비교하고 쥐의 피부 샘플도 분석하면 AGE에 대한 더 많은 수용체가 존재하기 때문에 각막 신경이 훨씬 더 민감한 것을 확인할 수 있습니다.

그림 3: thy1-YFP 쥐의 각막 내 뉴런.
A) 두꺼운 기질 신경 및 하위기저 신경총의 미세한 신경을 보여주는 개관. B)
빨간색 상자 클로즈업 및 C) 단일 하위기저 신경의 정량화. FV10i, 60x 오일 대물렌즈 사용. 기준자 50μm.

그림 4: 쥐 각막의 신경 구조.
컨포칼 현미경을 사용한 이 3D 재현에서 A 델타신경섬유(노란색)가 보우만 레이어를 관통합니다. 이들 신경섬유는 하위기저 신경총(빨간색)으로 확산됩니다.

Baltrusch 교수는 다음과 같이 설명합니다. “각막의 올바른 레이어를 찾아서 정확한 신경을 분석하는 것이 대단히 중요하지만 너무 얇아서 이것이 어려울 수 있습니다.” 이 경우에 컨포칼 현미경을 사용하는 것이 이상적입니다. 이를 통해 정확한 z-위치를 선택하고 3D 이미징으로 분석을 수행할 수 있습니다.

전체 상황

이 연구에서 한 가지 의문점은 각막 신경세포 건강을 잘 나타내는 데 얼마나 많은 사진이 필요한가 하는 것입니다. 신경 밀도 외에 신경 섬유 길이도 신경세포 건강의 지표이며 여기에는 대규모 시야가 필요합니다.
자동 이미지 스티칭 기능을 사용하여 FV10i로 대규모 시야를 획득할 수 있습니다. Baltrusch 교수는 “FV10i 를 선택한 주된 이유 중 하나는 이미지 정량화와 고속 처리 분석을 위해서입니다”라고 말합니다. “FV10i 의 이미지 스티칭으로 매우 근사한 오버뷰를 얻을 수 있습니다.”

그림 5는 하룻밤 동안 생성된 25개 z-슬라이스와 36개 이미지의 획득을 보여줍니다. 각막 이미지의 1/4을 획득하는 데는 3일이 걸립니다. 이러한 연장된 실험 내내 기계가 자율적으로 가동되며 FV10i의 자동 초점 루틴을 통해 스캔 필드가 다수 이미지 간 정초점을 유지합니다. 이것은 컨포칼 설정에 있어 기본 사항이 아니며 특히, 간편한 일체형 시스템의 경우에는 해당되지 않습니다. 사용자는 각 이미지의 초점을 맞추기 위해 기계 작업을 해야 하며 고품질 스티칭 이미지 획득 경험도 있어야 합니다. 신경 섬유 밀도 및 개별 신경의 길이를 정량화하기 위해 이미지 스티칭이 각막을 휠씬 더 통찰력 있게 나타냅니다. Baltrusch 교수는 “전체 각막을 보게 되면 더할 나위 없을 겁니다”라고 말합니다. FV10i로 그 이미지를 획득할 수 있기는 하지만 이 데이터 로드에는 이미지 분석 및 정량화를 위한 전문 소프트웨어가 필요합니다. 전체 각막은 160GB에 달하며, 각막의 1/4 미만에 대해 획득된 그림 5에 표시된 스티칭 이미지만으로도 약 6GB를 차지합니다.

그림 5: 이미지 스티칭을 통한 1-YFP 쥐 각막 시각화.

A) 다중 영역 타임 랩스 뷰어가 각기 25 z-레이어와 36개 단일 이미지를 보여줍니다. 표시된 흰색 직사각형 내 이미지는 3D 최대 투사(B) 및 3D 볼륨 뷰(C)로 보여집니다. 이미지 스티칭이 하위기저 각막 신경(A 및 D의 빨간색 직사각형)의 분석을 촉진합니다. FV10i, 60x 오일 대물렌즈 사용. 기준자 50μm.

향후 연구

이러한 연구를 통해 신경장애의 검출 촉진 외에 연구의 기타 방안이 열렸습니다. Baltrusch 교수는 다음과 같이 말합니다. “우리는 최초로 손상된 영역, 그리고 쥐에 인슐린을 처치할 경우 최초 결과가 무엇인지에 관심이 있습니다. 정말로 흥미로운 것은 [그림 5B에서] 신경 내 이 점들을 볼 수 있다는 것이며 방울 모양의 이 신경 섬유들이 갈라지므로 새로운 신경에 대해 중요하다는 것입니다.” 또한 정확한 당뇨 쥐 모델과 체내 및 체외 컨포칼 현미경 도구를 결합하는 것이 당뇨신경병 치료를 위한 새 화합물 시험에서의 이상적인 플랫폼입니다.

요약

진성 당뇨병은 다양한 원인 요소 및 영향과 연계된 복합병이며, Olympus FV10i 기반의 컨포칼 현미경이 Baltrusch 교수 및 연구 그룹의 연구에 중요한 역할을 하였습니다. 상세 및 고속 처리 분석을 가능하게 하는 FV10i는 사용자 친화적인 시스템과 강력한 컨포칼 현미경을 결합하여 미토콘드리아 네트워크 구조의 역할에 대한 이해를 높이고 신경장애 진단 기법의 개발을 촉진합니다.
“현미경 사용 경험이 없는 사람들도 고려하여 이제 전체 유기체의 당뇨병 사진을 생성하도록 모든 조직에 걸쳐 약 1,000개의 샘플을 분석할 수 있습니다.” 학생과 교수가 똑같이 고품질 결과를 생성할 수 있는 것이 학술 연구를 촉진하고 당뇨병 퇴치에 기여하기 위한 핵심 동인입니다.

정보

Simone Baltrusch 교수는 Rostock 대학 (독일) 의학생화학 및 분자생물학 연구소 부소장입니다.

협력

* Rostock 대학 의학학부의 협력 연구소 외, 의학생화학 및 분자생물학 연구소 소장인 Markus Tiedge 교수의 그룹
** Oliver Stachs 교수, Rostock 대학 의학학부의 안과학과 그룹리더

참고문헌

1. International Diabetes Federation (2013). IDF Diabetes Atlas Sixth edition.
www.idf.org/sites/default/files/EN_6E_Atlas_Full_0.pdf
2. Hofmeister-Brix A., et al. (2013) Identification of the ubiquitin-like domain of midnolin as a new glucokinase interaction partner. JBC 288(50):35824-39.
3. Yu X., et al. (2009). Dissecting the effects of mtDNA variations on complex traits using mouse conplastic strains.
Genome Res. 19(1):159-65.
4. Jheng H.F., et al. (2012). Mitochondrial fission contributes to mitochondrial dysfunction and insulin resistance in skeletal muscle. Mol. Cell Biol. 32(2):309-19.
5. Zhivov A, et al. (2013) Imaging and Quantification of Subbasal Nerve Plexus in Healthy Volunteers and Diabetic Patients with or without Retinopathy. PLoS ONE 8(1): e52157. doi:10.1371/journal.pone.0052157
6. Guthoff R.F, et al. (2005) Epithelial Innervation of Human Cornea. Cornea 24(5): 608-613