세포막에서의 단일 분자 형광 이미징

높은 개구수(NA)의 대물렌즈를 사용한 세포막 단일 분자 형광 이미징

서론

최근 세포 준비 기법과 현미경 광학 시스템의 발전을 통해 라이브 셀 내 단일 생체분자의 이미징이 가능하게 되었습니다. 생리학적으로 활성화된 리간드를 세포에 결합, 신호 분자의 이합체화 및 분자 복합체의 형성 같은 분자 동역학이 개구수가 매우 높은 특수 대물렌즈를 사용하여 살아있는 세포 내 단일 분자 수준에서 시각화될 수 있습니다. 본 연구에서 연구원들은 단일 분자 수준에서 세포막의 이온 채널 내 분자간 상호작용의 형광 이미징을 위해 개구수가 대단히 높은 Olympus 대물렌즈를 사용하였습니다.

높은 개구수(NA)를 가지는 특수 대물렌즈의 TIRF 적용

형광 단백질(FP) 표지된 이온 채널 아단위가 제노푸스 난모세포에 발현되고 TIRF 현미경에 의해 단일 분자 수준에서 관찰되었습니다(그림 1, 좌측). 개별 FP의 추계적 퇴색 이벤트는 ‘퇴색 단계’로 관찰되었습니다(그림 1, 우측). 단일 이온 채널 복합체 내 아단위의 수는 개별 형광 반점에서 퇴색 단계를 계수하여 결정될 수 있습니다.

제노푸스 난모세포에 발현된 형광 단백질 Kv4.2-mCherry(그림 2 좌측) 및 mEGFP-DPP10(그림 2 중앙)의 이미지가 TIRF 현미경 및 개구수가 높은 특수 대물렌즈를 사용하여 단일 분자 수준에서 관찰되었습니다.  각 빨간색 점은 단일 Kv4.2 채널(4합체)을 나타냅니다.  녹색 점의 일부는 빨간색 점(그림 2의 흰색 화살촉, 우측)과 중첩되며 이는 Kv4.2와 DPP10이 복합체를 형성하는 것을 나타냅니다.  단일 형광 반점에서 mEGFP의 퇴색 이벤트를 계수하여 복합체 내 아단위의 수를 계산할 수 있습니다. ¹  그림 2 그래프의 Kv4.2-mCherry/mEGFP-DPP10 점에서 4개의 퇴색 이벤트(녹색 화살표)가 관찰되었으며 이는 4개의 DPP10 아단위가 복합체에 포함된 것을 나타냅니다.
1 Ulbrich, Maximilian H. 및 Ehud Y. Isacoff. “Subunit counting in membrane-bound proteins.” Nature methods 4, no. 4 (2007): 319–321

결론

에바네센트(evanescent) 조명용으로만 설계된 높은 개구수 대물렌즈는 투과 심도가 낮은 에바네센트 파동장의 효율적 형성으로 인해 약한 형광등으로도 현저히 높은 대비 이미지를 생성할 수 있습니다. 이러한 유형의 관찰에는 단일 분자 수준의 형광 손실로 인한 형광 강도상 미세한 변화의 정량적 측정이 요구되지만 특수 이멀젼 오일 및 커버슬립과 함께 높은 개구수의 특수 대물렌즈를 사용한 관찰은 제노푸스 난모세포 막의 이온 채널의 분자간 상호작용의 이미지를 촉진합니다. 이들 이미지의 신호 대 잡음비가 높기 때문에 형광 강도 변화를 정량적으로 측정할 수 있습니다.