편광 현미경, 그리고 편광 현미경이 골격 조직을 구성하는 물질에 대해 우리에게 알려주는 것

서론

편광 현미경은 복굴절 표본의 대비를 향상시키는 고급 광학 기법입니다. 다양한 유기 및 비유기 재료의 구조와 구성에 대한 뛰어난 인사이트를 제공합니다. 

선형 편광과 원형 편광이라는 두 가지 유형의 편광 현미경이 흔히 사용됩니다. 이름에서 알 수 있듯이, 선형 편광 현미경은 선형으로 편광된 빛을 사용하여 표본에 조명을 비춥니다. 이와 대조적으로, 원형 편광 현미경은 원형으로 편광된 빛을 활용하므로 표본 내 구조의 키랄성(chirality, 왼쪽 방향 또는 오른쪽 방향)에 특히 민감합니다. 이러한 기법들은 생물학, 재료 과학, 지질학 등의 분야에서 다양한 재료의 미세 구조 및 특성을 관찰하는 데 사용됩니다.

이 애플리케이션 노트에서는 골격 조직의 복굴절 재료를 더 효과적으로 시각화하는 원형 편광 현미경을 중심으로 이러한 편광 기법을 자세히 알아보겠습니다. 

골격 조직의 복굴절 재료

복굴절성은 단일 입사광선이 재료를 통과할 때 두 개의 개별적 광선으로 나뉘는 재료의 특성을 말합니다. 피부, 각막, 힘줄, 인대, 근육 조직, 연골, 뼈는 모두 이방성(광학적 특성이 모든 방향에서 균일하지 않음) 구성의 구조 때문에 복굴절성을 보이는 조직과 기관입니다. 이러한 복굴절성은 뼈와 연골과 같은 골격 조직의 재료가 편광과 상호작용하는 방식에 영향을 줍니다.

포유류와 조류의 뼈는 주로 콜라겐과 인산칼슘으로 구성된 경직성 재료입니다. 뼈에서 관찰되는 네 가지 세포 유형은 다음과 같습니다. 

1. 조골세포(새 뼈를 만듦)
2. 골세포(뼈 기질에 포함됨)
3. 파골세포(뼈를 재흡수함)
4. 골조상세포(조골세포를 만듦)

연골은 뼈와 함께 골격 조직을 구성합니다. 이러한 특수 연결 조직은 유연하면서 튼튼합니다. 연골은 다음과 같은 세 유형으로 나뉩니다.

1. 유리 연골: 코, 갈비뼈, 기관, 후두, 기관지, 뼈의 관절 표면 등 신체 전반에서 볼 수 있는 가장 흔한 유형. 이 연골은 태아의 골격 및 성장판을 형성하여 배아 발달과 성장 기간 동안 중요한 역할을 수행합니다. 태아의 골격 및 성장판은 나중에 뼈로 대체됩니다. 
2. 섬유 연골: 척추골 및 일부 관절에서 볼 수 있습니다. 
3. 탄성 연골: 후두개, 성대, 외이에서 볼 수 있습니다.

여러 성분이 뼈와 연골 건강에 영향을 주는 것으로 알려져 있습니다. 그중 하나는 아스코르브산이라고도 부르는 비타민 C입니다. 과학 연구에 따르면 비타민 C는 콜라겐 형성에 필요하고 조골세포 내 뼈 기질 유전자 발현을 유도할 수 있기 때문에 뼈 건강에 필수적인 것으로 확인되었습니다. 또한, 비타민 C는 콜라겐 합성을 촉진하므로 연골에서 골관절염(관절 퇴화를 유발하는 질병)의 속도를 느리게 할 수 있습니다.

선형 편광 현미경 및 원형 편광 현미경 이해하기

편광 현미경을 사용하여 뼈, 연골, 비타민 C 및 기타 복굴절 재료에서 고품질 이미지를 얻으려면 먼저 선형 및 원형 편광 조명 방법을 이해해야 합니다.

광원은 360도로 진동하는 편광되지 않은 빛을 생성합니다. 편광되지 않은 빛이 편광기를 통과하면 선형 편광으로 바뀝니다. 샘플을 통과하는 선형 편광. 표본이 등방성(모든 방향에서 광학적 특성이 균일함)인 경우, 편광에 영향을 미치지 않으며 빛은 편광된 상태를 유지합니다. 그러나, 샘플이 이방성인 경우, 빛이 통과할 때 빛의 편광성이 달라집니다. 이러한 편광성의 변화 때문에 빛은 편광기와 직각 방향인 분석기를 통과할 수 있습니다. 

선형 편광의 단점은 등나선상이 형성된다는 점입니다. 등나선상은 시야에 나타나는 몰타의 십자(V자 모양의 팔을 가진 십자) 패턴의 어두운 띠입니다. 등나선상은 촬영된 샘플이 방사대칭을 이루고 있을 때 생깁니다. 방사대칭으로 인해 편광이 방사 중심 주변에서 갈라지고 분석기를 통과할 수 없는 빛이 만들어집니다. 몰타의 십자는 강도를 감소시키므로 정량화 또는 분석에 이미지를 사용하는 데 영향을 미칩니다.

원형 편광은 이러한 단점이 없습니다. 원형 편광도 일반적인 빛을 단일 평면에서 진동하는 빛(선형 편광)으로 변환하는 편광기를 사용합니다. 그러나 원형 편광의 경우 4분의 1 파장판(quarter-wave plate)과 같은 복굴절 재료가 편광의 경로에서 편광기와 45° 각도를 이루어 배치됩니다. 빛에는 위상이동이 발생합니다. 위상이동은 빛의 파장이 재료를 통과하는 데 걸리는 시간의 차이입니다. 그 결과, 원형으로 회전하는 빛이 만들어집니다. 원형으로 회전하는 빛이 표본을 통과할 때, 360도로 회전하며 모든 위치에서 굴절됩니다. 굴절 광 경로에 첫 번째 파장판과 90° 각도로 두 번째 4분의 1 파장판을 배치하면 이 효과가 사라집니다. 이 경우, 다시 선형 편광이 형성되므로 분석기의 투과 축을 통과할 수 있습니다. 편광기를 기준으로 두 개의 4분의 1 파장판 모두 45° 각도로 회전되지만, 방향이 반대라는 점에 주목해야 합니다.

그림 1. Evident의 SLIDEVIEW™ VS200 연구용 슬라이드 스캐너와 MPLFLN40X(0.75 NA) 대물렌즈를 사용하여 a) 선형 및 b) 원형 편광 현미경으로 촬영한 비타민 C 결정체. (a) 선형 편광의 경우 특징적인 등나선상(검은색 띠)을 볼 수 있습니다. (b) 동일한 샘플에 원형 편광을 사용한 경우, 아티팩트를 볼 수 없습니다.
 

편광 현미경을 사용한 뼈, 연골, 비타민 C 이미지 촬영

아스코르브산이라고도 알려진 비타민 C는 키랄성 분자입니다. 편광된 빛이 비타민 C 결정체를 통과할 때, 이 분자의 키랄성 때문에 빛의 편광 평면이 회전됩니다. 이러한 빛의 간섭은 다양한 색상을 만들며 아름다운 이미지를 형성합니다.

그림 2. 편광 현미경으로 촬영한 비타민 C 이미지. a) 선형 편광을 사용한 경우, 특징적인 등나선상(몰타의 십자)을 볼 수 있습니다. b) 원형 편광은 몰타의 십자가 생성되지 않습니다. 여기에 제시된 갈색 돌과 같은 구조물은 매우 두꺼운 결정체입니다. MPLAPON50X(0.95 NA) 대물렌즈를 장착한 VS200 연구용 슬라이드 스캐너를 사용하여 촬영한 이미지.

그림 3. 연결 조직 및 뼈의 이미지, 다양한 방향의 콜라겐 섬유가 편광으로 시각화됨. a) 선형 편광을 사용하여 시각화된 연결 조직. b) 원형 편광을 사용하여 시각화된 연결 조직. c) 선형 편광을 사용하여 시각화된 뼈의 횡단면. d) 원형 편광을 사용하여 시각화된 뼈의 횡단면. 가로 방향으로 정렬된 콜라겐 섬유는 밝게 보이지만, 세로 방향으로 정렬된 콜라겐 섬유는 어두워 보입니다. 중간 방향의 섬유는 다양한 종류의 회색으로 보입니다. MPLAPON50X(0.95 NA) 대물렌즈를 장착한 VS200 연구용 슬라이드 스캐너를 사용하여 촬영한 이미지.

골격 조직 및 비타민 C 연구에서 편광 이미징의 중요성

편광 현미경을 사용하여 아름다운 이미지를 촬영하면 미적 즐거움을 누릴 수 있습니다. 하지만, 이러한 이미지가 과학에 의미하는 바는 무엇일까요? 비타민 C의 경우, 분자와 편광의 상호작용은 비타민 C의 농도와 순도를 확인하기 위한 화학적 분석 작업에 사용됩니다. 일반적으로 편광계를 사용하여 이 작업을 수행합니다. 

뼈의 경우, 원형 편광 현미경을 사용한 연구를 통해 콜라겐 섬유 방향의 패턴을 파악합니다. 이러한 연구 결과는 뼈 부하(bone strain) 데이터와 연관지어 사용되어 왔습니다. 이제 대체로 가로 방향인 콜라겐 섬유는 압축력에 대한 저항성이 더 뛰어나고, 세로 방향 섬유는 인장력에 대한 저항성이 더 뛰어난 것으로 알려져 있습니다. 또한 박판과 45° 각도를 이루는 방향의 콜라겐 섬유는 전단에 대한 저항성이 더 뛰어납니다. 

연골 내 콜라겐 섬유의 방향 역시 부하 적용 또는 운동으로 인한 압력과 변형에 대한 저항성을 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다. 연골 내 콜라겐 구성이 경미하게라도 손상되는 경우 골관절염과 같은 질병을 유발할 수 있습니다. 

*VS200 스캐너용 원형 편광 구성품은 현재 EMEA 지역에서만 판매되고 있습니다. 판매 여부에 대한 자세한 내용은 현지 Evident 영업 담당자에게 문의하십시오.
 

참고 문헌

1. Bromage, T., et al. 2023. "Circularly Polarized Light Standards for Investigations of Collagen Fiber Orientation in Bone." The Anatomical Record. 274(1): 157–168. 
2. Chin, K. Y., and I-N. Soelaiman. 2018. "Vitamin C and Bone Health: Evidence from Cell, Animal, and Human Studies." Current Drug Targets. 19(5): 439–450.
3. Aghajanian. P., et al. 2025. "The Roles and Mechanisms of Actions of Vitamin C in Bone: New Developments." Journal of Bone and Mineral Research. 30(11): 1945–1955.
4. Khebtsov, N., et al. 2016. "Chapter 1: Introduction to Light Scattering by Biological Objects." Handbook of Optical Biomedical Diagnostics. 2nd ed., vol. 1: Light-Tissue Interaction, edited by V. V. Tuchin. 
5. Xia. Y., et al. 2016. "Chapter 1: Introduction to Cartilage." Biophysics and Biochemistry of Cartilage by NMR and MRI. Royal Society of Chemistry. 1–43.
6. Clark. A., et al. 2002. "The Effects of Ascorbic Acid on Cartilage Metabolism in Guinea Pig Articular Cartilage Explants." Matrix Biology. 21(2): 175–184.
7. Mittelstaedt. D., et al. 2011. "Quantitative Determination of Morphological and Territorial Structures of Articular Cartilage from Both Perpendicular and Parallel Sections by Polarized Light Microscopy." Connective Tissue Research. 52(6): 512–522.

저자

Laura Lleras Forero, 제품 마케팅 관리자, 생명 과학 연구 부문, EMEA, Evident
Heiko Gäthje, 수석 강사, Training Academy, Evident