스페로이드의 형광 이미지 분석-살아있는/죽은 세포 분석

컨포칼 현미경 및 NoviSight™ 소프트웨어의 세포 계수 모듈을 사용하여 스페로이드 내 죽은 세포의 비율과 약효를 정량적으로 평가할 수 있습니다.

목적

종양의 표면에서 코어까지의 거리는 산소 또는 영양소의 확산 기울기를 가지며 이 가혹한 환경은 종양 조직 내부 깊은 곳에 휴지 세포 또는 죽은 세포를 야기합니다. 스페로이드 모델이 종양 미세환경을 재현할 것으로 예상됩니다. 이전에는 3D 샘플 내부를 관찰하기 위해 각 부분을 별도로 준비해야 하였습니다. 하지만 현재는 조직 투명화 기술의 발전으로 인해 구조를 온전히 보존하면서 3D 샘플 내부를 관찰할 수 있습니다. 본 연구에서는 약제 처리되고 고정되어 투명화된 형광 착색 암 스페로이드의 컨포칼 이미지가 NoviSight™ 소프트웨어를 사용하여 3D 정량 분석의 대상이 되었습니다 . 연구 결과, 투명화 시약 및 NoviSight™ 소프트웨어를 사용하여 약제 독립적 및 약제 의존적 세포 죽음을 확인할 수 있음이 입증되었습니다.

샘플 제공

HT-29의 세포 현탁액을 500개 세포/웰로 U자형 웰 플레이트인 PrimeSurface®96U plates(SUMITOMO BAKELITE CO., LTD)에 파종하였습니다. 세포 배양 시작 8일 후에 다양한 농도의 스타우로스포린(STS) 및 NucView550을 각 웰에 추가하였습니다. 1일 동안 배양 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 0.5% TritonX-100/PBS로 투과시켰습니다. 그런 다음 세포 핵을 4°C로 하룻밤 동안 Hoechst 33342로 착색하였으며 스페로이드를 ScaleS로 투명하게 하였습니다.

결론
형광 이미지의 획득 및 분석

FV3000 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 상기 스페로이드의 컨포칼 형광 이미지를 획득하였습니다. STS가 없음에도 불구하고 스페로이드 내부 깊은 곳의 세포 핵이 NucView550로 착색되었습니다(A). 즉 세포자멸이 발생하는 것입니다. NoviSight™ 소프트웨어를 사용한 세포 핵 인식 및 형광 이미지 분석을 통해 죽은 세포 비율의 정량화가 가능하며(B), STS 유발 세포 죽음이 투여 의존적 방식으로 발생한 것이 확인되었습니다(C,D). 이러한 결과는 NoviSight™ 소프트웨어가 약제로 인해 유발된 3D 세포 죽음의 정량적 평가에 기여할 수 있는 방법을 보여줍니다.

PrimeSurface는 Sumitomo Bakelite Co., Ltd의 등록 상표입니다.
Olympus는 등록 상표이며 NoviSight 및 Insightful Analysis, Intelligent Answers는 Olympus Corporation의 상표입니다.