3D 살아있는/죽은 세포 분석에 대한 분석 워크플로

요약

NoviSight 3D 세포 분석 소프트웨어는 부피, 구형도 및 세포 번호 같은 매개변수를 측정하여 스페로이드 및 기타 3D 객체에 대한 통계 데이터를 제공합니다. 이 애플리케이션 노트에서는 살아있는/죽은 스페로이드 분석에 대한 NoviSight 3D 세포 분석 워크플로를 소개합니다.

서론

방법

샘플 제공

스페로이드를 형성하기 위해 8일 동안 PrimeSurface® 96U 플레이트(Sumitomo Bakelite)에 500 HT-29 셀/웰을 배양한 후 다음 날 NucView® 550(Biotium)을 사용하여 다양한 농도의 스타우로스포린(STS)을 적용하였습니다. NucView 550은 카스파제-3 형광 프로브이며, 죽은 세포핵들은 빨간색 형광으로 착색되었습니다. STS와 NucView 550을 사용하여 처리 후 HT-29 스페로이드를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 0.5% Triton X-100/PBS(-)로 투과시켰습니다. 스페로이드의 핵들은 4°C(39.2°F)로 하룻밤 동안 Hoechst 33342로 착색되었습니다. 착색 후 스페로이드를 SCALEVIEW-S4로 세정하였습니다.

이미징 및 분석

FV3000 컨포칼 현미경과 세미 아포크로맷 대물렌즈(LUCPLFLN20X)를 사용하여 샘플의 3D 이미지를 획득하였습니다. 아래에서 획득 조건을 확인할 수 있습니다. Z 스텝 크기는 2μm였습니다. 405nm 레이저를 Hoechst 33342(파란색 형광)에 사용하였고, 561nm 레이저를 NucView 550(마젠타색 형광)에 사용하였습니다. 그림 2는 현미경을 사용하여 획득된 비처리 및 STS 처리 스페로이드의 용적 이미지를 보여줍니다. 8일간 배양된 비처리 스페로이드의 코어는 저영양이나 저산소증으로 죽었을 것으로 예상됩니다. 전반적으로 STS가 HT-29 스페로이드의 세포 죽음을 유도하였습니다.
 

그림 2: STS 적용(우측) 및 미적용(좌측) HT-29 스페로이드의 용적 그림.
 

이점

• 3D 살아있는/죽은 생존율 테스트 수행이 용이함
• 직관적 사용자 인터페이스를 통해 Z 스택 이미지를 재현가능한 정량적 데이터로 변환 가능
   

3D 살아있는/죽은 분석 전략

NoviSight™ 소프트웨어를 사용하여 살아있는/죽은 스페로이드를 정량적으로 분석하는 데 표 1에 기술된 단계가 필요합니다. NoviSight 소프트웨어가 Z 평면 이미지의 핵들을 입체적으로 인식하도록 Z 섹션의 스텝 크기를 단일 핵을 검출하기 위한 최대 치수인 3μm으로 설정합니다.
 

표 1: 샘플 제공에서 분석에 이르는 3D 워크플로.
 

NoviSight 소프트웨어 분석 단계

주 객체 인식

살아있는/죽은 세포의 수로 살아있는/죽은 세포 분석을 평가하였습니다. NoviSight 소프트웨어는 핵 염색에서 세포 수를 검출할 수 있습니다. 세포 핵을 인식하기 위하여 다음과 같은 핵 검출을 위해 전문화된 NoviSight 모듈을 사용하였습니다. NuclearL. 해당 세포 크기, 배경 강도 및 Z/XY 비율(핵의 Z 축 신장)을 입력하면 NoviSight 소프트웨어가 3D 공간에서 스페로이드의 핵들을 자동으로 검출할 수 있습니다(그림 3A).

분석 매개변수 설정

Hoechst 33342로 착색된 모든 핵들의 경우 높은 NucView 550 신호 강도의 핵들은 죽은 세포였습니다. 결과적으로 NoviSight 소프트웨어는 인식된 핵 객체에서 CH2(NucView 550) 강도 레벨로 살아있는/죽은 세포를 분류할 수 있습니다(그림 3B). 즉 NoviSight 소프트웨어는 핵 인식 설정만으로 스페로이드의 살아있는/죽은 세포를 분류할 수 있습니다.

그림 3: 부모 객체의 인식. (A) NuclearL 모듈을 사용하여 핵들을 인식하였습니다. 인식된 각 핵은 다채로운 원으로 둘러싸여 있었습니다. (B) 분석 매개변수를 설정하였습니다. 예를 들어 매개변수 10은 주 객체(핵)에서 CH2(죽은 신호) 최대 강도입니다.
 

핵 인식을 완료하면 인식된 핵들을 산포도 또는 히스토그램의 객체 데이터로 표시할 수 있습니다. 분석 매개변수에서 산포도의 X 또는 Y 축을 조정할 수 있습니다. 매개변수를 중앙 X/Y에 각기 설정하면 주객체의 중앙 X/Y가 그래프에 표시됩니다(그림 4A). 그래프의 점을 클릭하면 NoviSight 소프트웨어가 원래 이미지의 동일 위치를 가리킬 수 있습니다(그림 4B).
 

그림 4: 스페로이드의 정량 분석 이미지. (A) 중앙 X 및 Y 분석 매개변수(그림 3B에 설정됨)가 X 및 Y 축에 각기 설정되었을 때 인식된 각 핵이 그래프에 표시되었습니다. 필요에 따라 X/Y 축의 분석 매개변수를 조정할 수 있습니다(빨간색 정사각형). (A/B) NoviSight 소프트웨어는 분석 데이터를 원래 이미지와 시각적으로 연결할 수 있습니다. 그래프에서 인식된 핵을 클릭하면(A, 빨간색 화살표), 동일 위치가 원래 이미지에 자동으로 표시됩니다(흰색 화살표).
 

그림 5: 세포 분류를 위한 그래프 분석.
(A) 분석 매개변수 평균 강도 CH2(그림 3B에 설정됨)를 X 및 Y 축에 각기 설정하였을 때 CH2(죽은 신호) 평균 강도 순으로 주 객체 계수(핵)가 그래프에 표시되었습니다. CH2 강도 게이팅을 통해 살아있는 세포와 죽은 세포를 나눌 수 있었습니다. (B) 인식된 죽은 영역의 용적 그림은 녹색으로 표시되었습니다.
 

통계 분석

NoviSight 소프트웨어는 여러 샘플을 동시에 분석할 수 있습니다. 분석 기반의 정량적 데이터는 열지도(그림 6A)로 표시하거나 추가 분석을 위해 CSV 파일로 내보낼 수 있습니다. 데이터를 각 게이팅에서 출력할 수도 있습니다. 여기서 STS의 다양한 농도가 HT-29 스페로이드 내에서 처리되었을 때 STS는 투여 의존적 방식으로 HT-29 세포 자멸을 유도하였습니다(그림 6B).

그림 6: STS 적용 또는 미적용 HT-29 스페로이드에 대한 살아있는/죽은 세포 분석의 정량화 결과. (A) NoviSight 소프트웨어가 각 게이트에 대해 정량화 데이터를 출력합니다.
데이터를 열지도로 표시할 수도 있습니다. (B) STS는 투여 의존적 방식으로 HT-29 세포 죽음을 증가시켰습니다.
 

연결 데이터 및 이미지

데이터와 이미지 간 링크는 대용량 분석의 주요 이점에 해당합니다. 플레이트 리더와 달리 HCA는 세포의 형태, 위치 및 강도를 육안으로 확인하기 위해 원래 이미지를 참조할 수 있습니다. NoviSight™ 소프트웨어는 이러한 기능을 최대한 이용합니다. 예를 들어 다음과 같은 데이터 점이나 객체(그림 7)를 클릭하면 소프트웨어가 해당 이미지를 보여줄 수 있습니다.

• 산포도에서의 점
• 갤러리 뷰에서의 객체 이미지
• 열지도에서의 웰(well)
• 표에서의 수
   

그림 7: 데이터 점이나 객체를 클릭하면 NoviSight 소프트웨어가 해당 이미지의 동일 위치를 보여줄 수 있습니다.
 

결론

3D 샘플의 3D 정량 분석은 복잡해 보일 수 있지만 NoviSight 소프트웨어는 처음부터 끝까지 워크플로를 간소화할 수 있습니다. 예를 들어 핵 인식은 스페로이드의 살아있는/죽은 분석에 필요한 유일한 매개변수입니다. 이 간소화된 워크플로는 관련된 3D 모델에도 적용될 수 있습니다.

저자

Mayu Ogawa(Olympus)