높은 처리량 약제 스크리닝의 3D 공간 분석

다중 샘플에 대한 약효를 정확히 평가하기 위해 NoviSight™ 소프트웨어를 사용하여 암 스페로이드의 고속 3D 이미지를 분석하였습니다.

서론

스페로이드가 복잡한 종양 미세환경을 나타내기 때문에 3D 암 스페로이드를 사용한 약제 성능 평가가 중요합니다. 이를 통해 연구원들은 종양의 자연 환경과 더욱더 흡사한 매개변수에서 약효를 평가할 수 있습니다. 스페로이드를 사용한 고속처리 약제 스크리닝을 수행하기 위해 연구원들은 간단한 프로토콜의 반자동 고속 이미징 및 멀티웰 3D 분석을 사용해야 합니다. 
본 연구에서는 액체 교환 없이 384웰 플레이트를 사용하여 동질 세포 생존율 분석을 수행하였고 FV3000RS 컨포칼 현미경의 공진 스캐너를 사용하여 고속 이미지를 촬영하였으며 NoviSight 3D 소프트웨어로 이미지를 분석하였습니다. 다중 샘플에 대한 약효를 정확히 평가하기 위해 스페로이드를 3D로 분석하였습니다.
 

적용 워크플로

이점

• 액체 교환이 필요 없는 간단한 프로토콜 사용
• 고속 공진 스캐너를 사용하여 자동으로 이미지 캡처
• 공간 분석으로 다중 샘플을 정확히 분석
   

방법

세포 준비

HeLa 자궁경부 암세포가 Corning® 384웰 원형 바닥 플레이트(웰당 100개 세포)에 파종되었으며 10% 소태아혈청(FBS)으로 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)에 24시간 동안 배양되었습니다. 플레이트를 가볍게 원심분리하여 기포를 제거하였습니다.

샘플 준비

시스플라틴 및 스타우로스포린(STS) 약제를 다양한 농도로 샘플에 추가하고 24시간 동안 배양하였습니다. 막투과성의 차이를 기반으로 Thermo Fisher Scientific®에서 ReadyProbes™ 세포 생존율 이미징 키트를 통해 전체 세포 대 죽은 세포를 계산하여 세포 생존율을 확정하였습니다(전체 세포: 파란색/ 죽은 세포: 녹색). 그런 다음 샘플을 착색하여 5시간 동안 배양하였습니다. 이러한 간단한 방법에는 세포 파종에서 이미징까지 액체 교환, 고정 또는 투명화가 필요하지 않습니다.

이미징 및 분석

LUCPFLN20X 세미 아포크로맷 대물렌즈가 있는 FV3000RS 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 스페로이드의 형광 이미지를 획득하였습니다. 이미징 영역의 설정 후 현미경의 공진 스캐너가 이미지를 자동으로 캡처하였습니다. NoviSight™ 소프트웨어는 웰의 위치 및 샘플 위치 같은 플레이트에 대한 정보와 페어링된 다중 이미지에서 데이터를 가져올 수 있습니다. 가져오기가 완료되면 소프트웨어는 이미지를 3D로 복원합니다. NoviSight 소프트웨어는 핵 같은 객체를 인식한 후 객체 내 다양한 신호를 분석할 수 있습니다.
 

그림 1 액체 교환 없는 고속처리 약제 스크리닝 방법
 

결과

다중 샘플의 고속 3D 이미징

단일 웰(2.33μm 두께, 122슬라이스, 2채널)의 Z 스택 이미지를 이미지를 관찰하는 데 약 1분이 소요되었습니다. 시스플라틴 및 STS 처리를 통해 투여 의존적 방식으로 죽은 세포의 수가 증가되었습니다(그림 2^*). 

그림 2 스페로이드를 사용한 약제 반응의 고속 이미징^*
 

스페로이드 내 약제 감수성의 고속처리 3D 분석

전체 세포 신호(파란색)를 통해 핵들을 인식할 수 있었습니다(그림 3A^*). 그런 다음 녹색 신호의 존재 또는 부재를 기준으로 모든 세포를 살아있는 세포 또는 죽은 세포로 분류하였습니다(긍정적 신호: 죽은 세포/ 부정적 신호: 살아있는 세포). 긍정적 신호와 부정적 신호는 그래프에서 선택된 이미지를 확인하여 분류되었습니다(그림 3B^*). 분류 후 소프트웨어에서 열지도를 사용하여 스페로이드 내 죽은 신호의 전체 강도를 쉽게 확인할 수 있습니다(그림 4A). 그런 다음 전체 세포 대 살아있는 세포의 비율을 계산하여 표시하였습니다(Fig. 4B). 그 결과, 두 약제가 모두 HeLa 세포에 매우 민감한 것으로 밝혀졌습니다.
 

(A)

(B)

그림 3 NoviSight™ 소프트웨어는 신호를 기반으로 객체를 인식하고 분류할 수 있습니다^*
 

그림 4 열지도 표시 및 용량 반응 곡선

약제 감수성의 고속처리 공간 분석

본 연구에서는 이미지를 3D로 캡처하여 첨단 공간 분석을 수행하였습니다. NoviSight™ 소프트웨어를 사용하여 분석을 위한 대상 부위를 설정할 수 있습니다. 소프트웨어를 설정하여 각 스페로이드의 중심과 주변을 분석하였습니다(그림 5A). 그런 다음 이 영역 내에서 집단 분석을 수행하였습니다. 이 방법을 통해 멀티 웰 플레이트에서 다수의 스페로이드에 대한 약효의 공간 분석을 수행할 수 있습니다. 그런 다음 소프트웨어가 중심 및 주변 영역에서 세포 수 대 각기 죽은 세포의 비율을 계산하였습니다(그림 5B). 
이 경우에 중심 및 주변 영역에서 모두 죽은 세포의 수가 투여 의존적 방식으로 증가하였습니다. 시스플라틴과 비교하여, 스타우로스포린이 저농도에서도 스페로이드의 중심 부분에 효과적입니다.
 

그림 5. NoviSight 소프트웨어는 스페로이드 부위의 첨단 공간 분석을 수행할 수 있습니다
 

결론

간단한 프로토콜, 고속 컨포칼 이미징 및 NoviSight 소프트웨어를 사용하여 스페로이드 내의 세포 생존율을 분류하고 약제 반응성을 분석하기 위해 고속처리 3D 이미지를 획득하였습니다. 이러한 공간 분석 기법을 통해 다중 샘플에 대해 보다 첨단의 약제 평가를 수행할 수 있습니다.

저자

Hiroya Ishihara, 생물학적 평가 기술 2, 연구개발

*비록 헬라 세포가 의료 연구에서 가장 중요한 세포주가 되었다고 해도, 과학에 대한 Henrietta Lacks의 공헌이 동의를 받지 않은 것이었다는 것을 인정해야만 합니다. 이로 인해 면역학, 전염병, 암에 대한 중요한 발견이 이루어졌지만 사생활, 윤리, 의학적 동의에 대한 중요한 논의도 촉발되었습니다.
Henrietta Lacks의 삶과 현대 의학에 대한 그녀의 공헌을 알아보려면 여기를 클릭하세요.
http://henriettalacksfoundation.org/