발육 중에 쥐 배아의 장기 3D 라이브 셀 이미징에 대한 실리콘 침지 대물렌즈의 적용

발육 중인 쥐 배아의 장기간 3D 라이브셀 이미징

현미경의 발전으로 배아 발생 중 일어나는 여러 현상이 밝혀졌으며 이것이 발생 생물학 분야의 주요 연구 초점이 되었습니다. 특히 컨포칼 현미경이 더 널리 사용되었으며 이를 통해 연구원들은 배아 발생 중 개별 세포 및 접합체의 단백질, DNA 및 기타 분자의 선명한 3D 형광 이미지를 획득할 수 있게 되었습니다.
이 분야의 연구가 빠르게 진전되면서 컨포칼 현미경은 3D 형광 이미징에 뿐 아니라 시간의 흐름에 따라 동적 변화를 캡처하기 위해 장기적 3D 라이브 셀 이미징에 사용되고 있습니다. Olympus는 고대비[PG1]의 장기적 3D 라이브 셀 이미징을 가능하게 하는 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 개발하였습니다.
이 애플리케이션 노트에서는 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 약 4일간 접합체에서 배반포 스테이지까지 쥐 배아의 체외 발육 중 3D 고대비 라이브 셀 이미징의 예를 소개합니다.
이 애플리케이션 노트는 긴키 대학 생물학지향과학학부 유전공학과 부교수 Dr. Kazuo Yamagata 및 동료들이 수행하여 2014년 6월 Stem Cell Reports에 발표한 연구에 기초한 것입니다.

착상 전 발육 중 MethylRO 쥐 초기배의 장기적 3D 라이브 셀 이미징을 위한 실리콘 이멀젼 대물렌즈의 사용

1）살아있는 세포 내 후생적 변화를 시각화하기 위한 MethylRO 쥐 생성

연구원들은 메틸화된 DNA를 인식하는 methyl-CpG 결합역 단백질 1(MBD1)의 methyl-CpG 결합역(MBD)에 빨간색 형광 단백질을 용해시켜 형광 프로브를 생성하였습니다. 그런 다음 유비쿼터스 유전자 발현으로 알려진 ROSA26 장소를 표적화하고 전신에 걸쳐 이 프로브를 발현하도록 유전적으로 수정된 쥐 균주에 해당하는 MethylRO 쥐를 생성하였습니다.

그림 1. 메틸화된 DNA의 시각화를 위한 신생아 MethylRO 쥐(노란색 화살표).
자극 광선으로 조사된 경우 전신이 필터를 통해 빨간색으로 빛납니다(우측 패널).

2）60X 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용한 착상 전 발육 중 초기배의 장기적 3D 라이브 셀 이미징

Dr. Yamagata와 동료들은 약 4일 동안 착상전 배아의 초기 발육 중에 MethylRO 쥐(그림 1)에서 세포의 타임 랩스 3D 라이브 셀 이미징을 위해 컨포칼 현미경을 사용하였습니다.
연구원들은 라이브 셀 관찰을 위해 설계된 Olympus 실리콘 이멀젼 대물렌즈를 사용하였습니다. 실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)은 살아있는 조직의 굴절률(ne≈1.38)에 가깝습니다. 오일 또는 워터 이멀젼 대물렌즈 사용 시 생물학적 샘플과의 굴절률 불일치로 인해 발생하는 구면 수차가 실리콘 이멀젼 대물렌즈에서 감소되어 연구원들은 더 큰 깊이에서 심도 있는 고대비 형광 이미징을 획득할 수 있습니다. 또한, 실리콘 오일은 4일 동안 따뜻한(37 °C) 환경에 사용 시 워터 또는 오일 이멀젼와 비교하여 건조하게 되거나 고체화되지 않음으로써 장기적인 안정적 고해상도 3D 라이브 셀 이미징을 지원합니다.
Dr. Yamagata의 팀은 이전에 라이브 셀 이미징의 심도 있는 관찰의 표준이었던 오일 렌즈 및 워터 이멀젼 대물렌즈를 사용하였습니다. 연구원들은 실리콘 이멀젼 대물렌즈로 바꾸면서 단세포 접합체에서 배반포 스테이지까지 약 4일 동안 표면에서 내부 영역까지 핵 내의 형광으로 표지된 메틸화된 DNA(mCherry-MBD-NLS)를 볼 수 있었습니다.

그림 2. 착상 전 발육 중 MethylRO 배아의 라이브 셀 이미징.
핵 내 메틸화된 DNA(mCherry-MBD-NLS)의 변화가 4일 동안 관찰되었습니다.

위의 그림 2와 동영상 1은 장기적 이미징 중 형광 광퇴색은 경미한 수준으로 핵 내 메틸화된 DNA의 명료한 이미징이 가능하였음을 보여줍니다. 동영상 2에서는 높은 개구수(1.3) 및 긴 작동 거리(0.3 mm)의 대물렌즈를 사용하여 전체 100mm 배반포의 3D 이미지가 성공적으로 획득되었습니다.

결론: 장시간에 걸친 심도 있는 고대비 3D 라이브 셀 이미징의 실현에 실리콘 이멀젼 대물렌즈의 사용이 필수적입니다.

Olympus의 30/40/60/100X 실리콘 이멀젼 대물렌즈 라인업은 높은 개구수(NA) 및 긴 작동 거리를 제공합니다. 실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)이 살아있는 조직의 굴절률(ne≈1.38)에 가깝기 때문에 굴절률 불일치로 유발된 구면 수차가 두꺼운 조직의 관찰 시 감소되므로 고해상도 이미징이 가능합니다. 또한 실리콘 오일은 건조하게 되지 않기 때문에 실험 중에 이멀젼액을 추가할 필요가 없습니다 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 전동 도립현미경 IX 시리즈의 Z-드리프트 보상 시스템 IX-ZDC와 호환됩니다. 이 시스템을 사용하면 연구원들이 장기적 관찰 동안 지속적으로 초점이 맞고 기온 변화의 영향을 받지 않는 이미지를 획득할 수 있습니다. 또한 실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)이 Olympus가 공급하는 광학 투명화제인 SCALEVIEW-A2의 굴절률(ne≈1.38)에 필적하므로 이 시약 사용 시 굴절률 불일치가 최소화됩니다. 광학적으로 세정된 표본 사용 시 개구수가 높은 실리콘 이멀젼 대물렌즈는 최적 성능을 제공합니다.

이미징 조건
이미징 시스템: 연구용 도립현미경 IX 시리즈
대물렌즈: 실리콘 이멀젼 대물렌즈 UPLSAPO60XS
컨포칼 스캐너 장치: CSU-X1(Yokogawa Electric Corporation)
EMCCD 카메라: iXON3 DU897E-CS0(Andor Technology)

이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
Dr. Kazuo Yamagata, 긴키 대학 생물학지향과학학부 유전공학과 부교수

이 애플리케이션 노트의 연구에 대한 자세한 내용은 아래 글을 참조하십시오.

Ueda, Jun, Kazumitsu Maehara, Daisuke Mashiko, Takako Ichinose, Tatsuma Yao, Mayuko Hori, Yuko Sato, Hiroshi Kimura, Yasuyuki Ohkawa 및 Kazuo Yamagata. "Heterochromatin dynamics during the differentiation process revealed by the DNA methylation reporter mouse, MethylRO." Stem cell reports 2, no. 6 (2014): 910-924.