CM20 배양 모니터링 시스템을 사용한 인체 iPS 세포계 비교: iPS 세포 유도된 간 오르가노이드로의 분화 관찰

서론

신약 개발 연구 및 질병 진단 방법 개발을 위해 세포 분화 및 장기 형성 같은 발생학에 대한 기초 연구에 유도 다능성 줄기(iPS) 세포가 널리 사용됩니다. 현재까지 세계적으로 많은 iPS 세포계가 설정되었지만 균주 간에 분화 가능성 및 성장 속도 같은 속성이 다릅니다. 이러한 차이점은 비록 알려져 있지만 동일한 환경 조건에 따라 성장된 세포를 사용하여 정량화된 적이 없습니다. 따라서 이러한 변이가 실험실 간 환경 및 절차의 차이로 인한 것인지 또는 자체 세포계에 내재하는지 여부를 판단하는 것이 어렵습니다. iPS 세포에서 파생된 분화 세포의 속성에 변이가 있더라도 배양이 완료되기 전에는 변이가 발견되지 않으므로 분화하도록 유도된 세포에 이상이 있을 수 있습니다. 이러한 배경 하에서 분화 유도 실험까지 장기적 iPS 모니터링 및 효율적 품질 관리와 과정의 데이터 관리를 가능하게 하는 도구를 가지는 것이 중요합니다.

CM20 배양 모니터링 시스템을 사용한 정량적 세포 배양 데이터 분석

Olympus CM20 배양 모니터링 시스템에서 제공한 정량적 치수를 사용하여 iPS 세포에 의한 오르가노이드 생성의 변이에 대한 기준점을 분석하고 여러 표본 비교에 따른 질병 게놈 배경을 분석하기 위한 방법을 수립하였습니다. 본 연구에서는 각기 다른 기증자에게서 설정된 12개 인체 iPS 세포주가 동일한 과정을 사용하여 배양되었으며 Olympus CM20 배양 모니터링 시스템을 사용하여 각 세포계의 성장 과정에 대한 데이터를 확보하였습니다.

배양 프로토콜

StemFit AK02N 배지(Ajinomoto Co., Inc.) 및 iMarix-511(Matrixome Inc.) 플레이트 코팅 매트릭스를 사용하여 피더 비의존적 조건에 따라 6웰 플레이트에서 인체 iPS 세포 배양의 유지를 수행하였습니다. 배양물은 1.0–2.0 × 104 셀/웰에서 파종을 통한 분리식 Accutase 솔루션을 사용하여 계대배양되고 24시간 동안 Y-27632를 사용하여 보충된 StemFit AK02N 배지에서 배양되었습니다. 그런 다음, 인체 iPS 세포는 Y-27632 없이 StemFit AK02N 배지로 교체하여 증식된 후 이틀마다 배지를 교체하면서 약 1주 동안 배양되었습니다(그림 1 ).

그림 1. 인체 iPS 세포를 배양하는 방법

CM20에 의해 획득된 인체 iPS 세포의 이미지는 passage 후 1일, 4일 및 7일차 모니터링합니다. 파란색 영역은 모니터의 자동 콜로니 인식 기능에 의해 식별되었습니다.
파란색 영역은 모니터의 자동 콜로니 인식 기능에 의해 식별되었습니다.

12개 인체 iPS 세포주의 경우 5~8 passage 중에 성장 과정은 CM20 시스템을 통해 지속적으로 모니터링되었습니다(그림 2 A, B). 이러한 iPS 세포계에는 동시에 배지 교체와 계대배양이 진행되었습니다. 각 iPS 세포는 약 30시간의 배가 시간으로 증식되었으며 증식 속도는 iPS 세포계 간에 약간 다른 것이 확인되었습니다. 인체 iPS 세포계 간에는 배가 시간이 passage 간에 거의 일정한 iPS 세포계(예: B 균주 및 C 균주)가 있는 것도 확인되었습니다 이로써 배양 과정(예: 배지 교체 및 계대배양)이 정확히 수행되었음을 확인합니다(그림 2 C).

반면에 일부 iPS 세포계(예: 균주 I 및 균주 J)는 각 passage에 대한 배가 시간의 변이가 큰 것을 보여주었습니다(그림 2D). 이러한 결과는 12개 iPS 세포계의 성장 속성이 다르다는 것을 입증합니다.

그림 2. 인체 iPS 세포 배양 유지 중 정량적 증식 상태 모니터링

(A) CM20 모니터 소프트웨어 인터페이스.
(B) CM20 모니터를 사용하여 단일 웰 관찰. 3시간마다 웰 내 9개 시야의 이미지를 획득하고 매일 모든 웰 스캔을 자동으로 수행합니다.
(C) 여러 시간 동안 수행된 각 passage에 대한 배가 시간이 각 iPS 세포계에 대해 표시됩니다. 평균 ± 표준 편차(SD)가 막대그래프로 표시됩니다.
(D) 각 iPS 세포계에 대한 배가 시간의 변이가 SD로 표시됩니다.

정량 분석의 장점

CM20 모니터가 세포 성장 과정에 대한 정량적 데이터를 수집하기 때문에 동일한 기준을 사용하여 각기 다른 세포계의 데이터를 측정하고 비교할 수 있습니다. 이 모니터를 통해 여러 연구원들에게서 뿐 아니라 동일한 과정 하에 있는 단일 연구원에 의해 유지되는 다균주에서 데이터를 수집하는 것이 용이합니다. 이에 따라 세포 이미지와 성장을 비교하여 과정이 정확히 수행되었는지 확인하는 것이 용이합니다.   

세포 품질이 서로 달랐던 과거에는 그 원인이 개별 세포계의 속성상 차이에서 비롯된 것인지 또는 품질이 서로 다른 경우 배양 과정의 오류가 세포 배양 과정상 변이의 원인일 것인지 여부를 판단하기가 어려웠습니다. 특히 iPS 세포를 사용하는 많은 연구에는 원하는 분화 세포를 얻기 위해 많은 노력이 필요합니다. iPS 배양 유지 중에 발생할 수 있는 변화가 분화된 세포의 평가 결과에 어떻게 영향을 미치는지 측정하는 것이 어려웠습니다.

Olympus는 효율적 품질 관리 및 데이터 관리의 방법을 개발하기 위해 CM20을 사용하여 연구를 계속할 것입니다.

Dr. Takebe와 Dr. Yoneyama의 견해