Inner Focus 관절형 대물렌즈대 및 FVMPE-RS® 다광자 현미경을 통해 신속한 용적 측정 및 오프각 뇌 영상화를 수행할 수 있습니다.

서론

다광자 현미경은 작은 쥐에서 영장류 같은 대규모 포유류에 이르는 동물 모델의 세포 수준에서 뇌 구조 및 활동의 체내 연구를 위한 기본 도구가 되었습니다. 이러한 기법의 응용이 확대되면서 연구원들은 동적 뇌 반응을 연구하기 위해 갈수록 빠른 용적 이미징 수행을 계속 추구합니다. 또한 기존 현미경 설계로 도달하기 어려운 특정 뇌 영역에 접근하는 것에 관심이 증가되고 있습니다. Olympus Inner Focus 관절형 노즈피스는 이러한 어려운 문제를 해결합니다. 이 구성품을 Olympus FVMPE-RS® 다광자 현미경에 장착하고 움직일 수 있는 기계팔 장치를 사용하여 더 많은 자유도를 제공하며 현미경 광학계의 움직임 없이 축방향 초점 조정을 빠르게 할 수 있습니다.

Inner Focus 관절형 노즈피스

오프각 이미징

신경세포 회로의 수준에서 인지 뇌 기능에 대한 이해를 높이기 위해 많은 연구원들이 마카크 원숭이 같이 더 수준 높은 동물 모델에 다광자 현미경을 적용하기 시작하였습니다[2]. 하지만 특정 뇌 영역을 보기 위해 큰 동물을 적절히 적응시키는 것은 기존 현미경으로는 어려울 수 있습니다. 오프각 이미징을 가능하게 하는 시스템 수정은 대물렌즈를 사각으로 표본에 접근할 수 있게 하여 이러한 기계적 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.

Inner Focus 관절형 노즈피스는 다광자 현미경으로 오프각 이미징을 더 쉽게 만듭니다. 이 노즈피스는 현미경 프레임에서 떨어지도록 대물렌즈의 범위를 확장하며 동물 실험 설정을 수용할 공간을 더 많이 제공합니다. 다른 방향으로부터 관심 영역에 접근하기 위해 대물렌즈의 각도를 조작할 수 있습니다. 스테이지 이동에 의한 초점 조절은 큰 동물의 체내 연구 시 실용적이지 않습니다. 대신에 원격 광학 초점 메커니즘은 표본이나 대물렌즈의 기계적 움직임 없이 선택된 대물렌즈 각도에 따라 초점을 조정할 수 있습니다. Inner Focus 장치는 초점 범위 전체에 걸쳐 광학 배율 및 시야를 유지하도록 설계되어 있습니다.

프레임 결합

Inner Focus 관절형 노즈피스를 각기 다른 프레임에 부착하여 다양한 실험 설정을 수용할 수 있습니다. 그림 2a는 현미경 아래에서 큰 개방 부피(640mm × 355mm × 520mm; W × H × D)를 제공하는 Olympus FVMPE-RS 갠트리 프레임 옵션에 부착된 내부 초점 장치를 보여줍니다. Inner Focus 노즈피스에 장착된 XLPLN25XWMP2 다광자 대물렌즈의 최대 수직 간격은 바닥판에서 179mm입니다. 그림 2b는 유사한 대물렌즈로 최대 174mm 간격을 제공하는 수직면 프레임 옵션에 부착된 장치를 보여줍니다. 수직면 프레임은 현미경 아래 보다는 현미경 앞에 더 큰 자유 공간을 추구하는 전기생리학자 같은 연구원들을 위해 설계된 또 하나의 맞춤형 솔루션입니다.

a)

b)

그림 2: 갠트리 프레임(a)에 부착되고 수직면 프레임(b)에 결합된 내부 초점 장치.

다면 이미징

Inner Focus 노즈피스에 의한 빠른 초점 조정을 통해 연구원들은 온전한 뇌의 여러 깊이 평면에서 병렬로 동적 신경세포 활동을 기록할 수 있습니다. 이 기법은 각기 다른 심도에서 신경세포 간 상호작용을 조사하거나 동시에 더 독립적인 신경세포를 단순히 샘플링하는 데 사용될 수 있습니다. 아래 예에 별도의 두 평면에서 신경세포의 활성화는 FVMPE-RS 다광자 현미경에서 공진 스캐닝과 결합하여 Inner Focus 노즈피스를 사용해 동시에 기록되었습니다 .

그림 3은 AAV-hsyn-flex-G6f 바이러스가 이전에 주사된, 머리가 고정되고 얇은 두개골을 갖는 깨어 있는 쥐에서 후 신경구 위의 승모 세포의 활성화를 보여줍니다. Inner Focus 노즈피스는 이미지를 공진 스캐닝 모드로 캡처하면서 서로 45미크론 떨어진 각기 다른 두 평면에서 관심 영역 간을 빠르게 전환하는 데 사용되었습니다. 18 FPS의 총프레임률 동안 두 이미지 스트림이 각기 9 FPS에 캡처되었습니다. 두 평면에서 냄새 자극제에 대응하여 신경세포의 활성화가 뚜렷하며 이를 통해 연구원들은 각기 다른 축면에서 망으로 신경 활동에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 

그림 3: 얇은 두개골의 깨어 있는 쥐의 MVE 냄새에 대한 승모 세포의 Gcamp6 반응 두 평면은 축 방향으로 서로 45미크론 떨어져 있습니다. Inner Focus 노즈피스를 통해 고속, 다면 이미징을 위한 두 평면 간의 전환이 가능하였습니다.

요약

Inner Focus 장치는 달리 도달하기 어려운 관심 영역에 대물렌즈를 움직이는 기능과 표본이나 현미경 대물렌즈를 움직이지 않고 초점을 맞추는 기능을 포함하여 연구원들이 직면하는 여러 중요한 문제들을 해결합니다. 고속과 결합된 큰 축방향 초점 범위는 Inner Focus 관절형 노즈피스의 기타 장점에 해당하며 빠른 용적 및 다면 이미징을 가능하게 합니다. 이러한 특징은 이 장치를 체내 이미징 연구에 최적화합니다.

[1] Dombeck, Daniel A; Khabbaz, Anton N; Collman, Forrest; Adelman, Thomas L; Tank, David W (2007) Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron 56, 43–57.

[2] Ming, Li, Fang, Liu, Hongfei, Jiang, Tai Sing Lee, Shiming Tang (2017). Long-Term Two-Photon Imaging in Awake Macaque Monkey. Neuron 93, 1049–1057.