20X 높은 개구수(NA) 위상차 대물렌즈를 사용하여 플라스틱 배양 접시에 배양된 라이브 셀의 형광, 위상차 및 생물발광 이미징

서론
플라스틱 배양 접시에 배양된 줄기 세포 이미징

살아있는 세포의 형광 관찰에 사용되는 유리 바닥 배양 접시는 많은 배양 챔버 제조업체들에 의해 판매되고 있습니다. 하지만 일부 유형의 세포는 유리 표면에 성공적으로 배양될 수 없으며 플라스틱 배양 접시가 사용되어야 합니다.
iPS 세포(유도 다능성 줄기 세포) 및 ES 세포(배아 줄기 세포) 같은 특정 유형의 줄기 세포는 플라스틱 기질에서 배양될 때 표적 세포로 더 잘 분화될 수 있습니다. 사실상 일부 유형의 세포는 유리 바닥 접시에 배양될 경우 표적 세포로 전혀 분화될 수 없습니다. 하지만 플라스틱 배양 접시 사용의 불리한 점은 형광 이미징이 플라스틱 재료에서 생성된 자가 형광과 종종 겹쳐서 배경 신호 정도가 높아지는 데 있습니다. 이러한 현상이 발생하면 신호 대 잡음비가 손상되어 형광 샘플의 이미지 획득이 더 어려워집니다.
줄기 세포 연구원들은 플라스틱 배양 접시를 사용하여 생생한 형광 관찰을 수행할 수 있기를 바랍니다. 이러한 요구에 응하여 Olympus는 기존 20X 위상차 대물렌즈와 비교하여 개구수가 크게 개선된 20X의 높은 NA 위상차 대물렌즈(UCPLFLN20XPH)를 개발하였습니다. 개구수 개선으로 인해 신호 대 잡음비가 향상되어 플라스틱 접시로 형광 이미징 품질을 높일 수 있습니다. 그 결과, 연구원들은 형광 타임 랩스 이미징으로 줄기 세포 분화 과정을 더 효과적으로 관찰하고 플라스틱 배양 접시에 배양된 세포의 밀도 또는 트랜스펙션 비율을 더 쉽게 평가할 수 있습니다.
이 애플리케이션 노트에서는 Olympus의 20X 높은 NA 위상차 대물렌즈를 통해 플라스틱 바닥 접시에서 줄기 세포의 생생한 형광 및 위상차 관찰을 할 수 있는 방법과 동일한 대물렌즈를 사용한 생물 발광 이미징 관찰의 예를 제시합니다.

응용: Olympus의 20X 높은 NA 위상차 대물렌즈를 사용한 형광 및 위상차 관찰

핵에 GFP 표지된 히스톤(GFP-H2B)이 있는 쥐 배아 줄기(ES) 세포를 플라스틱 배양 접시에 배양하였습니다. 이들 세포를 기존 20X 위상차 대물렌즈(NA=0.4)로 이미지를 획득한 다음 Olympus의 20X 높은 NA(NA=0.7) 위상차 대물렌즈를 사용하여 획득한 이미지와 비교하였습니다. 

GFP-H2B 발현 쥐 ES 세포

상기 이미지 비교 시 20X 높은 NA 위상차 대물렌즈(UCPLFLN20XPH)를 사용하여 밝은 형광 이미지를 획득하였으며 핵들을 쉽게 관찰하였습니다. 이것이 가능한 이유는 대물렌즈의 개구수가 향상되었고 긴 작동 거리(W.D.: 0.8–1.8mm)를 유지하였기 때문입니다.
이들 이미지는 UCPLFLN20XPH 대물렌즈 사용 시 유리 바닥 접시를 사용하여 획득할 수 있는 형광 이미지에 필적하는 형광 이미지를 획득할 수 있음을 보여줍니다. 플라스틱 접시 바닥의 두께 차이로 인해 발생되는 구면 수차는 보정환의 도움으로 쉽게 보정될 수 있습니다.

사진 조건:
표본: 쥐 ES 세포
형광 표지: GFP-H2B
배양 챔버: 플라스틱 바닥 접시
대물렌즈: 높은 NA 위상차 대물렌즈 UCPLFLN20XPH
CCD 카메라: 디지털 현미경 카메라 DP80
현미경: 도립 연구용 현미경 IX73

응용: 모노크롬 CCD 모드를 사용하여 CCD DP80 디지털 현미경 카메라의 형광 감도 증가

위에서 설명한 바와 같이 Olympus의 높은 NA 20X 위상차 대물렌즈(UCPLFLN20XPH)를 사용하여 플라스틱 바닥 접시에 배양된 세포의 생생한 형광 및 위상차 관찰을 수행할 수 있습니다. 하지만 실험 중 표본의 형광을 확인하기 위해 배양기에서 접시를 반복적으로 꺼낼 경우 여기광에 의해 생성된 광독성을 최소화해야 합니다. 이 경우 고감도 CCD 카메라를 사용하면 샘플이 세포독성 광선에 잠재적으로 노출된 기간을 줄이면서 여기광의 강도를 줄일 수 있습니다.
Olympus의 DP80 디지털 현미경 카메라는 색 재현성 및 고감도 모노크롬 CCD 이미징의 이중 기능을 제공합니다. 아래 이미지에서 예시된 바와 같이 20X 높은 NA 위상차 대물렌즈(UCPLFLN20XPH)와 함께 DP80의 모노크롬 CCD를 이용하여 쥐 iPS 세포에 발현된 Nanog-GFP를 더 낮은 빛의 강도에서 효율적으로 검출하였습니다.

쥐 iPS 세포에 발현된 Nanog-GFP

사진 조건:
표본: 쥐 iPS 세포
형광 표지: Nanog-GFP
배양 챔버: 플라스틱 바닥 접시
대물렌즈: 높은 NA 위상차 대물렌즈 UCPLFLN20XPH
CCD 카메라: DP80 디지털 현미경 카메라
현미경: 도립 연구용 현미경 IX73

응용: 고성능 생물발광 이미징

Olympus의 20X 높은 NA 위상차 대물렌즈(UCPLFLN20XPH)는 플라스틱 배양 접시를 사용하여 생물발광 이미징 같은 힘든 애플리케이션에 대해 뛰어난 성능을 발휘합니다. 생물발광 이미징을 통해 사용자는 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 정량적으로 검출할 수 있습니다. 이러한 이미징 양식은 생물발광 이미징 전용 현미경인 Olympus LV200을 사용하여 쉽게 수행될 수 있습니다. UCPLFLN20XPH 대물렌즈를 LV200에 사용하면 단일 시야로 여러 세포를 관찰할 수 있습니다. 아래 이미지에 표시된 바와 같이 위상차 및 Nanog-Luc 생물발광(노란색)을 단일 세포 수준에서 고감도로 쥐 ES 세포에 쉽게 시각화할 수 있습니다.

사진 조건:
표본: 쥐 ES 세포
생물발광: Nanog-Luc
배양 챔버: 플라스틱 바닥 접시
대물렌즈: 높은 NA 위상차 대물렌즈 UCPLFLN20XPH
현미경: 생물발광 이미징 시스템 LV200

결론

제시된 예에서는 Olympus 20X 높은 NA 위상차 대물렌즈(UCPLFLN20XPH)를 통해 플라스틱 배양 접시에 배양된 세포의 생생한 형광, 위상차 및 생물발광 이미징을 수행할 수 있음을 보여줍니다. UCPLFLN20XPH 대물렌즈는 IX3-ZDC2 Z-드리프트 보상기 및 전동 도립 연구용 현미경의 IX3 시리즈와 호환됩니다. 전동 스테이지가 장착된 경우 플라스틱 바닥 접시에 대해 완전 전동 세포 기반 분석 시스템을 쉽게 구성할 수 있습니다.