NanoBiT® 기술을 사용한 단백질 대 단백질 상호작용의 세포 국소화 이미징

단백질-단백질 상호작용(PPI)은 두 개의 단백질 간의 직접적인 물리적 접촉을 말합니다.단백질이 대부분의 세포 과정을 수행하고 단독으로는 기능하지 않는다는 점을 고려했을 때, 약물 개발 및 질병 연구 등 연구 분야 전반에서 여러 쌍 또는 대규모 그룹으로 단백질 상호작용을 연구하는 것이 중요합니다.세포를 사용하지 않고 단백질-단백질 상호작용을 모니터링할 수 있는 다양한 방법이 있지만, 이러한 모델은 세포 내 환경을 정밀하게 반영하지 않습니다.게다가, 세포를 사용한 일부 PPI 모니터링 방법은 세포 용해와 양적 검출을 위한 특수 기기를 사용해야 합니다.

이 같은 문제점을 극복하기 위해서, Promega는 NanoLuc^® Binary Technology(NanoBiT^®)를 개발했습니다.NanoBiT^®는 PPI의 세포 내 검출에 사용될 수 있는 구조적 상보 보고자 시스템입니다.이는 약물 검사, 신호 변환 분석 및 바이러스 감염 기전 분석 등 다양한 연구 분야에서 성공적으로 사용되고 있습니다.

이 시스템은 대형 BiT(LgBiT,17.6kDa)와 소형 BiT(SmBiT,아미노산 11개) 아단위로 구성되어 있으며 이 요소들은 관심 단백질에 융합됩니다.이후 이 아단위들은 세포에서 발현되므로 표적 PPI만이 아단위가 밝은 발광 신호를 발산하는 기능 효소를 구성하도록 만듭니다(그림 1).

그림 1.NanoBiT^® 단백질-단백질 상호작용 시스템의 개요.
이미지 제공: Promega.
 

NanoBiT의 세포 내 국소화 이미징

세포액 및 핵 발현을 수행하기 위해, 두 종류의 벡터 쌍을 HeLa 세포에 감염시켰습니다.첫 번째 쌍은 나노표적 FKBP-SmBiT 대조군 벡터와 FRB-LgBiT 대조군 벡터였습니다.두 번째 쌍은 핵 표적 NLS¹-FKBP-SmBiT 대조군 벡터와 FRB-LgBiT 대조군 벡터였습니다(그림 2).FKBP와 FRB는 라파마이신 치료에 따라 결합되는 것으로 알려져 있습니다.

그림 2.FKBP/FRB NanoBiT 및 NLS-FKBP/FRB NanoBiT의 세포 내 국소화.
 

이후 IXplore™ Live for Luminescence 현미경 시스템을 사용해 NanoBiT 발현 HeLa 세포의 세포 발광을 이미징했습니다².핵 국소화를 확인하기 위해, HeLa 세포를 회흐스트 33342로 대비염색한 후 동일한 형광 현미경으로 이미징했습니다(그림 3).

그리고 비표적 FKBP/FRB NanoBiT를 받은 HeLa 세포의 생물발광 신호가 시토솔 전체에 확산되는 것을 관찰했습니다.그러나 회흐스트 33342 형광 염색과의 겹침 현상을 고려했을 때, NLS-FKBP/FRB NanoBiT의 생물발광이 핵에 국소화되는 것을 확인할 수 있었습니다.

그림 3.FKBP/FRB NanoBiT 및 NLS-FKBP/FRB NanoBiT의 세포 내 국소화.
 

실험 조건:

• 현미경: IXplore Live for Luminescence 현미경 시스템²
• 카메라: imagEM EM-CCD 카메라(Hamamatsu Photonics)
• 대물렌즈: LUCPLFLN60XPH
• 이미징 렌즈: 0.35배율
• EM 게인: 1200
• 푸리마진 농도: 1/200로 희석
• 라파마이신 최종 농도: 30nM
• 노출 시간: 위상차 50ms / 생물발광 3분 / 형광 100ms

그림 4는 라파마이신 자극 전후의 NLS-FKBP/FRB NanoBiT 생물발광 변화를 보여주고 있습니다.핵의 생물발광 강도는 라파마이신 자극 후 증가했습니다.이 결과는 FKBP와 FRB가 라파마이신 치료 중인 핵에서 결합되며 이 상호작용이 NanoLuc 생물발광을 유도한다는 점을 보여주고 있습니다.현미경 이미징을 통해 라파마이신 자극으로 유도된 FKBP 및 FRB 상호작용을 살아있는 세포의 시토솔과 핵 생물발광 강도 변화로 관찰할 수 있었습니다.

그림 4.라파마이신 자극에 의한 NLS-FKBP/FRB 생물발광 강도 변화.
 

실험 조건:

• 벡터: NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit 벡터(각 50ng)
• 현미경: IXplore Live for Luminescence 현미경 시스템²
• 카메라: imagEM EM-CCD 카메라(Hamamatsu Photonics)
• EM 게인: 1200
• 대물렌즈: UPLFLN40XPH
• 이미징 렌즈: 0.35배율
• 노출 시간: 위상차 50ms / 생물발광 30초 / 형광 100ms
• 타임랩스 간격: 40초

광도계 및 발광 현미경을 사용한 PPI 검출

NanoBiT 및 HiBiT³ 기술로 광도계를 사용하여 고속 대량 PPI를 검출할 수 있게 된 한편, 이러한 기술의 현미경 이미징으로 PPI의 세포 내 국소화를 시각화할 수 있게 됐습니다.

광도계를 PPI 검출 전용 발광 현미경과 결합하여 여러 가지 이점을 얻을 수 있습니다.국소 발생한 PPI 또는 세포 내 국소화의 변화를 관찰할 때, 광도계를 사용하여 고속 대량 측정 전에 현미경 이미징으로 국소화의 정확도를 확인할 수 있습니다.이 시스템은 세포 내 국소화를 확인하기 위해 추가적으로 형광 이미징을 해야 할 필요성을 해소했습니다.그리고 세포 내 국소화와 고속 대량 처리 광도계 검출을 확인하기 위해 NanoBiT 또는 HiBiT를 발현하는 동일한 구성의 세포주를 사용할 수 있습니다.

작성자

Taro Hayashi
연구자, 생물공학, 고급광학 생물공학, 연구 및 개발, Evident

^1.핵 국소화 신호(반복 핵 국소화 신호를 3번 사용했습니다).

^2.IXplore Live 현미경 기반의 생물발광 이미징 시스템.이 시스템은 일본 Tokai Hit Co, Ltd., 오사카 대학교의Nagai 교수와 Evident가 공동으로 개발했습니다.이 같은 노력은 고급 측정 및 분석 시스템을 개발하기 위한 Japan Science and Technology Agency 프로그램 하에서 수행됐습니다.

^3.11개 아미노산 펩타이드 태그(HiBiT)와 약 18kDa NanoLuc 루시페라아제 단편(LgBiT)을 사용한 생물발광을 통해 표적 단백질을 검출하기 위한 HiBiT 기술.