NIR 이미징을 사용하는 신형 형광 나노프로브의 종양 라벨링 검증

형광 이미징(FLI)은 높은 공간 및 시간 분해능과 높은 검출 감도, 신속한 반응 시간, 우수한 작동성 덕분에 전임상 및 임상 환경의 다양한 의생명 이미징 기법에 널리 사용되고 있습니다.형광 이미징에 근적외선(NIR) 기능을 적용하면 심부 관찰, 낮은 광독성 및 조직 자가형광에 대한 낮은 간섭 등 장점이 더해집니다.그 결과, NIR 형광 이미징은 의학 연구, 특히 종양 치료에서 대중적인 기법이 됐습니다.

NIR-II 영역의 형광 이미징

형광 단백질과 염료 같은 기존 형광 지표와 비교했을 때, 형광 나노프로브는 화학 조성과 형태적 크기를 조정해 NIR 여기 이미징을 쉽게 달성할 수 있습니다.또한, 형광 나노프로브는 국소화, 약물 전달 및 다중 모드 검출 용도로 추가로 수정할 수 있습니다.

최근까지, 연구진은 정밀 질병 진단과 치료 기회에 대한 높아지는 수요를 충족하기 위해 다양한 형광 프로브를 탐구하고 있습니다.그러나 대부분의 기존 형광 프로브는 가시 또는 NIR-I 영역(400~1,000nm)에 방출합니다.또한 얕은 조직 침투 깊이와 낮은 공간 분해능 같은 단점 때문에 의생명 이미징 분야에 응용하기에는 한계가 있습니다.

최근 연구에서 밝혀졌듯이, 형광 이미징은 NIR-II 영역(1,000~1,700nm)까지 확장됐습니다.저조도 산란과 낮은 자가형광의 이미징 특징 덕분에 심부 조직 관찰을 위한 고감도와 고선명도와 같은 뛰어난 가능성을 보이고 있습니다.그 결과, 이 방법은 기존의 형광 이미징을 사용해 쉽게 밝혀낼 수 없었던 생체 내 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

형광 이미징 기술이 계속 진화하고 있지만, 단일 모드 광학 이미징 방법만으로 생체 내, 심부, 초고도 감도, 3D 및 높은 시공간 분해능 검출에 대한 현재 요구 사항에 완벽하게 맞추기는 어렵습니다.그 결과, 다중 모드 광학 검출 시스템을 신속히 개발할 필요가 있습니다.

이미징 정확도를 개선하기 위한 바이오이미징 방법 결합

광음향 이미징(PAI)은 최근 몇 년 새 개발된 비파괴적 의생명 이미징 방법입니다.펄스 레이저가 생물체의 조직으로 조사될 때, 생물체의 조직에서 발생한 초음파 신호는 조직의 광흡수 특성에 관한 정보를 전달합니다.그 결과, NIR-II FLI 및 NIR-I PAI를 결합하여 각각의 장점을 활용하고 서로를 보완하는 이중 모드 이미징 결합이 이미징 정확도를 효과적으로 개선할 수 있습니다.이 결합은 효율적인 진단을 위한 뛰어난 응용 가능성을 가지고 있습니다.

고품질의 이미징을 얻으려면 프로브 설계가 특히 중요합니다.도너-억셉터-도너(donor-acceptor-donor, D-A-D) 구조가 있는 분자는 탁월한 생체적합성과 잘 정의된 화학 구조, 사용자 정의 가능한 광학 특성을 갖추고 있기 때문에 NIR-II 분자 설계에 대해 상당한 관심을 받아왔습니다.NIR-II 방출을 얻기 위해, 강력한 전자 결핍 유닛인 벤조[1,2-c:4,5-c']비스([1,2,5]싸이아다이아졸(BBTD)이 억셉터로써 널리 사용됐습니다(그림 1a).

그림 1.（a） BBTD 수용체를 기반으로 한 대표적인 D-A-D형 NIR-II 형광 분자(b) NIR-II 형광 분자 BTB의 화학 구조와 논문에서 보고된 제어 형광 분자 BBT.

D-A-D 구조의 NIR-II 분자 양자 수율(QY)은 강력한 분자 내 전하 전달(ICT) 효과 때문에 비교적 낮습니다.따라서 QY를 개선하기 위한 수많은 전략이 개발됐습니다.이러한 전략에는 단백질의 소수성 구조를 갖춘 염료에 결합, 응집 유도 방출 특성이 있는 형광단 구성, 분자 구조에 차폐 유닛 도입 및 터짐 방지 분자 설계 등이 있습니다.

그러나 가장 많이 보고된 NIR-II 형광 분자(D-A-D 구조를 갖춤)의 QY는 이의 내재적 ICT 효과 때문에 상대적으로 낮습니다.또한, BBTD는 비교적 혹독한 합성 조건이 필요합니다.따라서, 기능화로 인해 보다 발전된 NIR-II 형광 분자가 개발되는 것을 제한합니다.따라서 새로운 수용체 단위를 탐구하기 위해서는 NIR-II 형광 분자의 광범위한 응용을 위한 대안적인 설계 전략을 제공하는 것이 중요합니다.

NIR 형광 프로브 이미징의 기술적 요구 사항

NIR 다중 모드 프로브의 생체 내/생체 외 검출 또한 이미징 기구의 새로운 문제점으로 제기되고 있습니다.기존 공초점 이미징과 비교했을 때, NIR 형광 프로브 이미징은 다음과 같은 기술적 요구 사항을 충족해야 합니다.

1. 대부분의 기존 컨포칼 현미경은 400~650nm의 여기 파장을 가지고 있습니다.NIR 이미징은 >700nm 파장의 NIR 레이저가 필요합니다.
2. 기존 이미징 광학 구성 요소(예: 스캐닝 공명기, 대물렌즈 및 격자)는 전송/보정을 위한 육안 범위에만 머무릅니다.따라서 NIR 이미징의 효율성과 정확도를 보장할 수 없습니다.
3. NIR 검출은 >750nm NIR의 검출기가 필요합니다.일반적인 검출기는 NIR 영역에서 검출 효율성이 매우 낮습니다.

NIR-II 형광 및 광음향 이미징을 위한 신형 형광 나노프로브

SUSTech의 Li Kai 박사 그룹과난징기술대학교의 Liu Jie 박사 그룹, 및중국과학원 상하이제약학연구소의 Chen Hao 박사 그룹은 힘을 합쳐높은 흡광 계수와 양자 수율을 갖춘 NIR-II 형광 프로브를 개발하기 위한 수용체 공학에 대한 분자 설계 전략을 제안했습니다(그림 1b).이 전략으로 2차원 및 3차원 모드 조건에서 종양의 표적 검출을 위해 기능화된 프로브가 탄생했습니다.

2021년 11월 10일, 이 연구 결과는 “Receptor Engineering of Small Molecule Fluorophores for NIR-II Fluorescent and Photoacoustic Imaging(NIR-II 형광 및 광음향 이미징을 위한 저분자 형광단의 수용체 공학)”이라는 제목의 논문으로 Journal of Materials Chemistry B의 온라인 플랫폼에 발표됐습니다.

저희는논문의 제1 저자 중 한 명인 Yaxi Li 박사에게 주요 결과물과 전반적인 연구 경험을 공유해 달라고 요청했습니다.

1.바이오이미징에서 신형 형광 나노프로브의 장점은 무엇입니까?

기존의 형광 프로브는 종양 자체를 표적으로 하지 않고 강화된 투과성 및 체류 효과(EPR 효과)로 인해 종양 부위에 남아있으므로 종양의 생체 내 이미징에 사용할 수 있습니다.그러나 이 수동적 강화 접근법은 특정 크기의 나노입자가 필요하고 흔히 비효율적입니다.따라서 종양 부위의 형광 프로브를 강화하고 높은 정확도의 생체 내 진단을 위해 이미징 효과를 높이고자, Arg-Gly-Asp(RGD) 표적 펩타이드로 나노프로브 표면을 수정해 BTB-RGD NP 나노프로브를 얻었습니다.

그림 2a와 같이, 48시간 동안 긴 정맥을 통해 BTB-RGD NP를 주입 받은 마우스 모델은 종양 부위에서 NIR-II 형광 신호가 상당히 높아졌으며 이 신호는 48시간 시점에 최댓값에 도달했습니다.이와 비교해, 표적 기능 없이 BTB NP를 주입한 대조군 마우스는 종양 부위의 형광 신호가 미약하게 증가했습니다.정량 분석(그림 2b)에 따르면, BTB-RGD NP를 주입한 마우스의 종양 부위 신호는 대조군의 신호보다 항상 높았습니다.

형광 이미징 외에, 종양 부위 BTB-RGD NP의 전반적인 표적 효과를 추가로 확인하기 위해 광음향 단층 촬영(PAT)이 사용되었습니다(그림 2c).BTB-RGD NP를 주입한 마우스의 종양 부위에서 광음향 신호 강도는 대조군인 치료한 마우스의 것보다 높아 NIR-II 형광 이미징 결과와 일치했습니다.

그림 2.（a）808nm 레이저(140mW cm-2) 여기에서 BTB-RGD NP 또는 BTB NP를 72시간 동안 주입 받은, 143B 종양이 있는 마우스 모델의 NIR-II 형광 이미징 이미지, 필터: 1,000nm 롱 패스.화살표는 피하 종양을 나타냅니다.그룹당 마우스 수 (n) = 4.스케일 바 = 5mm.(b) 72시간 동안 이미징된 143B 종양의 T/NT 비율.데이터는 평균 ± SD, n = 4로 표시됐습니다.(c) BTB(왼쪽) 또는 BTB-RGD Np(오른쪽)을 48시간 동안 주입 받은 마우스의 143B 종양(730nm 여기)의 3차원 광음향 이미지.스케일 바 = 2mm.

이 이미징 결과는 이중 모드 바이오이미징 응용 분야를 위해 설계한 형광 프로브의 강력한 가능성을 성공적으로 입증했습니다.한편으로는, NIR-II 형광 이미징의 높은 감도를 통해 종양 가장자리의 선명한 2차원 이미징을 확보하는 데 성공했습니다.다른 한편으로는, 형광 이미징과 비교했을 때 PAT는 시간 분해능과 감도가 비교적 낮지만, 뛰어난 공간 분해능과 3D 시각화를 제공할 수 있습니다.

이 이중 이미징 접근법은 임상 중개 응용 분야에서 매우 중요하게 여기는 종양 조직 용적 이미지의 재구성을 가능하게 할 것입니다.예를 들어, 의사들은 종양 조직의 3D 용적 정보를 평가하여 단일 용량의 조영제로 안내된, 수술적 종양 제거를 위한 형광 이미징을 수행할 수 있습니다.따라서 단일 조영제를 사용하는 이 두 가지 이미징 모드를 통합하면 정밀한 혈관 이미징과 암 치료에 엄청난 기회를 제공할 수 있습니다.

2.NIR 영역에서 이미징할 때 직면했던 기술적 어려움은 무엇이 있었습니까?그리고 어떻게 해결하셨습니까?

BTB-RGD NP의 표적 기능을 증명하기 위해, 먼저 세포 분석을 통해 종양 세포에 대한 표적 기능을 확인해야 했습니다.그러려면 컨포칼 현미경을 사용해야 했습니다.그러나 대부분의 기존 컨포칼 현미경에는 가시 영역에 대해 제한적인 레이저가 장착되어 있습니다.따라서 NIR-II 표적 프로브를 확인하기 위해 가시 영역에서 프로브를 비슷한 구조와 교체하여 표적 기능을 간접적으로 증명할 수 있었습니다.그러나 이 접근법으로는 NIR-II 프로브 자체의 표적 기능을 육안으로 증명할 수 없었습니다.또한 실험하는 동안 프로브 준비를 위한 작업량도 늘었습니다.

따라서 NIR 레이저가 장착된 컨포칼 현미경이 특히 중요했습니다.이 어려움을 해결하기 위해, FV3000 Red 근적외선(NIR) 이미징 솔루션으로 업그레이드된 FLUOVIEW™ FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용했습니다.FV3000 Red 시스템을 사용하여 종양 세포의 BTB-RGD NP 표적 기능을 성공적으로 증명했습니다.그림 3은 40μg mL^-1 BTB- RGD Np만으로 배양한 후 종양 세포의 형광 신호가 BTB NP 대조군의 형광 신호보다 유의하게 높다는 것을 보여줍니다.이와 반대로, BTB-RGD NP로 배양한 정상 3T3 세포의 형광 강도는 BTB NP 치료의 형광 강도와 유의하게 다르지 않았습니다.이러한 결과는 RGD로 기능화한 후 나노입자가 α_vβ³ 인테그린에 과다노출된 종양 세포에 대해 특정 표적 효과를 촉진할 수 있다는 것을 시사합니다.

그림 3.4시간 동안 40μg mL-1의 BTB-RGD 또는 BTB NP로 배양한 3T3, PC3 및 U87 세포의 공초점 이미지.여기 파장: 730nm, 필터: 760~890nm, 스케일 바 = 50μm.

이전 실험에서, 종양 라벨링은 간접적으로만 확인할 수 있었습니다.시스템의 관찰 범위가 가시광선에만 제한되어 있기 때문에, 가시 범위에서 프로브를 비슷한 구조로 교체하여 실험을 수행했습니다.이 실험에서는 FV3000 Red 시스템을 사용하여, 프로브를 교체하지 않고 종양 세포의 BTB-RGD NP 라벨링을 성공적으로 측정할 수 있었습니다.

컨포칼 현미경을 위한 근적외선(NIR) 솔루션

FV3000 Red 시스템은 NIR 영역에 대한 FV3000 현미경의 파장 검출 기능을 확대했습니다.레이저, 광학 장치, 대물렌즈 및 검출기 등 NIR 검출용 각 이미징 모듈을 업그레이드하여 FV3000 RED 시스템은 보다 감도 높고 정확한 다중 색상 NIR 이미징을 위한 특별한 솔루션을 제공합니다.

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