자동 매크로-마이크로 이미징을 사용한 3D 암 스페로이드의 약물 생존력 테스트

서론

현미경 관찰은 스페로이드 또는 오가노이드에 대한 항암제의 의학적 효과를 평가하는 효과적인 방법입니다.그러나 이미징 워크플로는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 현미경에서 샘플을 찾고 이미징하는 데 시간을 들여야 하기 때문입니다.

저희는 이 작업의 효율성을 극적으로 향상시키는 혁신적인 이미징 모듈인 자동 매크로-마이크로 이미징을 개발했습니다.자동 매크로-마이크로 이미징은 수동 현미경 작업을 자동화된 이미징 및 물체 감지로 바꿀 수 있습니다.이 애플리케이션 노트에서는 자동 매크로-마이크로 이미징을 사용하여 3D 암 스페로이드의 약물 생존력 테스트를 실시한 사례 연구를 소개합니다.

재료 및 방법: 샘플 준비

사람의 유방암 세포주 MCF-7 세포를 96웰 U 플레이트(PrimeSurface, Sumitomo Bakelite)에서 웰당 2,000개의 세포로 시딩했습니다.배양 3일째에 항암제(Paclitaxel, 5-FU, Cisplatin)를 여러 가지 농도로 첨가했습니다.24시간 배양 후, 회흐스트 33342, 프로피디움 요오드화물(propidium Iodide(PI)), 칼세인-AM을 첨가하고 1시간 동안 배양했습니다.모든 세포의 핵은 회흐스트 33342로 염색했고, 사멸 세포의 핵은 PI로 염색했으며, 생세포는 칼세인-AM으로 염색했습니다.그런 다음 Olympus FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 자동 매크로-마이크로 소프트웨어 모듈을 사용하여 세포를 관찰했습니다.

자동 매크로-마이크로 이미징의 작동 방식

자동 매크로-마이크로 이미징을 사용하는 경우 미리 관찰 방법을 설정해 놓기만 하면 다음 작업을 자동으로 수행할 수 있습니다.

먼저, 자동 매크로-마이크로 이미징은 저배율 대물렌즈(1.25배~4배 대물렌즈)를 사용하여 전체 웰(Z축 포함)의 개요 이미지를 촬영합니다.인식한 이미지(매크로 이미지)를 기반으로, 각 웰의 샘플 위치와 두께를 자동으로 감지합니다.그런 다음, 최적의 이미징 위치(XYZ)를 계산하고 고배율 대물렌즈(마이크로 이미지)를 사용하여 샘플을 세부적으로 이미징합니다.샘플이 마이크로 이미징에 사용되는 대물렌즈의 관측 시야보다 크면 시스템이 여러 이미지를 자동으로 함께 연결할 수 있습니다(그림 1).

그림 1.매크로-마이크로 도식화 이미지
 

현미경 작업은 15~20분 정도 소요되며 최초 관찰 방법이 설정되어 있을 때만 필요합니다.자동 매크로-마이크로 이미징이 실행된 후, 사용자는 이미징이 완료되는 동안 현미경과 PC 앞을 떠나 다른 작업을 수행해도 됩니다.결과적으로, 현미경을 작동하는 데 소요되는 시간이 크게 줄어듭니다.또한 웰마다 샘플의 두께나 위치가 다르더라도 시스템이 각 샘플을 최적의 Z축 범위로 이미징할 수 있습니다.이렇게 하면 이미징 시간이 짧아지고 이미징 데이터의 양이 줄어듭니다.

매크로-마이크로 이미징 단계

이미징 결과

다양한 항암제로 처리한 MCF7 스페로이드를 칼세인-AM과 PI로 염색하여 생존력을 시각화했습니다.FV3000 컨포칼 현미경용 자동 매크로-마이크로 이미징 모듈을 사용하여 적절한 위치에서 촬영한 60웰의 고해상도 이미지를 신속하게 인식할 수 있었습니다.현미경 작업은 15분밖에 걸리지 않았습니다(그림 2).

그림 2.항암제의 생존력 테스트를 위해 자동 매크로-마이크로 이미징 모듈 조정
 

기존의 관찰 워크플로에서는 적절한 이미징 조건을 얻기 위해 샘플의 위치를 한 번에 하나씩 지정해야 했습니다.자동 매크로-마이크로 이미징 모듈을 사용하여 이 작업을 제거했습니다.또한 이미징에 소요되던 시간을 다른 작업에 사용할 수 있어 작업 효율성이 향상됩니다.

분석 결과

NoviSight™ 3D 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 자동 매크로-마이크로 이미징 모듈에서 인식한 이미지 파일을 열면 다중 웰 이미지를 동시에 3D로 분석할 수 있습니다.

모든 핵은 MCF7 회흐스트 33342의 강도로 인식되었습니다.칼세인-AM과 PI의 강도에 따라 인식된 핵이 생세포인지 사멸 세포인지 분류하여 생존력을 평가했습니다.결과적으로, 단일 세포 수준에서 각 항암제의 생존력을 성공적으로 평가할 수 있었으며 그 내용은 알려진 보고서와 일치합니다(그림 3과 그림 4).

그림 3.칼세인-AM/PI 강도를 사용하여 생세포와 사멸 세포를 분류하는 NoviSight 분석
 

그림 4.NoviSight 분석을 사용한 스페로이드 생존력 결과
 

결론

자동 매크로-마이크로 이미징 모듈을 사용하여 현미경과 PC를 작동시킨 후 약 15분이 지나 적절한 이미지 위치에서 마이크로플레이트의 60웰을 이미지화할 수 있었습니다.

웰을 한 번에 하나씩 수동으로 이미징하려면 이미징 시간을 포함하여 현미경과 PC 앞에서 6시간 이상 간헐적으로 작업해야 할 것으로 예상합니다.자동화된 이미징 모듈을 사용하면 현미경과 PC를 작동하는 데 약 15분이 걸리며 이미징이 완료되는 동안 다른 작업을 수행할 수 있습니다.

또한 자동 매크로-마이크로 이미징과 NoviSight 소프트웨어를 결합하여 다중 웰 이미지를 일괄적으로 분석할 수 있습니다.이 설정을 사용하면 이미지 인식부터 다중 웰 스페로이드 샘플 분석까지의 워크플로를 원활하게 진행할 수 있습니다.
 

Mayu Ogawa
연구원, R&D - Olympus Corporation