SLIDEVIEW VS200 연구용 슬라이드 스캐너를 사용하여 매우 두꺼운 형광 샘플 계수화

서론

독일 드레스덴에 위치한 Max Planck 분자세포 생물학 및 유전학 연구소(MPI-CBG)의 연구원들은 Olympus SLIDEVIEW VS200 연구용 슬라이드 스캐너를 사용하여 플라나리아 편형동물 슈미테아 메디테라네아(Schmidtea mediterranea)의 재생 기능을 연구하고 있습니다. 슈미테아 메디테라네아는 계통 재생 생물학을 연구하기 위한 인기 있는 모델입니다.

슈미테아 메디테라네아 사용 장점:

1. 실험실 내 충분한 수의 동물을 저렴한 비용으로 유지
2. 최근에 연속된 게놈
3. RNA 간섭(RNAi)을 통한 유전자 기능 손실 연구를 위한 도구 및 방법 설정

슈미테아 메디테라네아의 재생 기능 이해

MPI-CBG의 연구원들은 슈미테아 메디테라네아의 놀라운 특성을 이용하고 있습니다. 아주 작은 조각으로 자른 경우에도 각 조각은 완벽한 비율로 축소된 완전한 플라나리아로 다시 재생될 수 있습니다. 단일 세포가 완전한 벌레를 복원할 수 있기 때문에 이 과정에서 다 자란 줄기 세포가 중요한 역할을 합니다.

현재 많은 연구원들은 슈미테아 메디테라네아의 재생 방법을 더 명료하게 이해할 수 있도록 연구하고 있습니다. 이러한 목적을 향한 중요한 단계의 하나는 슈미테아 메디테라네아의 인접성이 가장 높은 게놈 조립이었습니다. MPI-CBG의 연구원들은 HITS(Heidelberg Institute for Theoretical Studies)와 공동으로 네이처를 통해 이에 대해 보고하였습니다.*

이 조립을 통해 기발한 거대 반복 요소와 새로운 편형동물별 유전자가 포함된 게놈이 밝혀집니다. 하지만 이 게놈에는 동물의 생명을 유지하는 데 절대적으로 필요한 것으로 생각된 기타 유전자가 부족합니다. 이러한 발견은 재생 연구, 줄기 세포 생물학 및 생물정보학의 분야에 잠재적 영향을 미칩니다.

슈미테아 메디테라네아의 고해상도 형광 이미지 캡처

MPI-CBG의 연구원들은 슬라이드 스캐닝 시스템의 강력한 기능을 사용하여 연구를 수행합니다. 연구원들은 VS200 슬라이드 스캐너를 사용하여 고해상도 형광 이미지를 획득합니다.

MPI-CBG의 Dr. Tobias Boothe는 “Olympus VS200 스캐너는 고해상도 이미지를 쉽게 획득할 수 있게 해줄 뿐 아니라 실시간으로 흐릿함을 제거하는 기능인 TruSight Live를 제공합니다”라고 설명하였습니다.

준비된 표본은 슬라이드 위에 고정된 후에 잘리기 때문에 상당히 두껍습니다. 이러한 200–300μm 두께의 표본과 함께 시스템의 TruSight Live 또는 Z 스택 기능이 필수적입니다.

TruSight Live 옵션을 통해 연구원들은 초점면의 위와 아래 영역으로부터 집중을 방해하는 산란 현상을 줄일 수 있습니다. 그런 다음 특수 2D 디콘볼루션 알고리즘으로 이미지 데이터를 다시 계산합니다. 이렇게 하면 이미지가 더 분명해지고 선명해집니다.

연구 목적상, 슈미테아 메디테라네아는 성적으로 성숙한 개체 내 두 개의 난황선 표지의 이중 형광(빨간색 및 녹색) 현지내 교배로 착색되고 VS200 슬라이드 스캐닝 시스템에서 10× 배율로 스캔된 슬라이드에 고정되었습니다. DAPI를 사용한 핵 대조염색도 획득되었습니다. 두 개의 표지는 페리틴과 계면활성제 b였으며, 둘 다 플라나리아에 난황 표지 처리되었습니다.

아래의 좌측 이미지는 온라인 디블러가 적용되지 않은 스캔을 보여줍니다. 우측 이미지에서 스캔 중에 세 개의 모든 채널(DAPI, FITC, CY3)에 TruSight Live가 적용되었습니다.

이중 형광(빨간색 및 녹색) 현지내 교배로 착색되고, DAPI로 대조염색되고, 10× 배율로 스캔된 슈미테아 메디테라네아. 좌측: 온라인 디블러 없음. 우측: 세 개의 모든 채널(DAPI, FITC, CY3)에 온라인 디블러가 적용됨. 각 신호 주위의 플레어가 제거되기 때문에 우측 이미지가 좌측 이미지보다 더 선명합니다. Miquel Vila-Farré, MPI-CBG에서 제공한 샘플.

“현재 획득 중인 이미지와 데이터는 다 자란 플라나리아의 재생 조직의 풍족과 동물 재생 능력 간 관계를 이해하는 데 있어서 지속적인 조사를 위한 필수적 소스입니다. MPI-CBG의 Dr. Miquel Vila-Farré는 이를 위해 그림에 표시된 바와 같이 유전자 계면활성제 B 및 페리틴 같은 다중 표지가 필요합니다.

TruSight Live의 대안으로 아래의 이미지에 표시된 바와 같이 최대 31개 평면을 포함하는 가상 Z 스택도 획득할 수 있습니다.

이중 형광(빨간색 및 녹색) 현지내 교배로 착색되고 10× 배율로 스캔된 슈미테아 메디테라네아. 좌측: 31개 평면이 포함된 가상 Z 스택. 우측: 1개 평면이 포함된 이미지. Miquel Vila-Farré, MPI-CBG에서 제공한 샘플.

이미지 획득 후 Z 스택을 통해 균일하게 초점을 맞추고 동일한 두께를 통해 신호 분포를 확인할 수 있습니다.

다음 이미징 예에서는 플라나리아 슈미테아 메디테라네아 내 두 배설계 표지(Smed-cubilin-1(FITC, 녹색)과 새로운 유전자(dd_2920, CY3 빨간색))의 이중 형광 현지내 교배를 확인할 수 있습니다. 핵 염색에는 DAPI(파란색)가 사용되었습니다. MPI-CBG의 Dr. Hanh Vu는 “플라나리아 배설계의 구조적 조직과 척추동물 네프론의 구조적 조직을 비교하기 위해 Smed-cubilin-1과 dd_2920을 표지로 사용하여 플라나리아 배설계의 두 가지 세포 유형인 근위세뇨관 세포와 여과 세포를 각기 시각화하였습니다”라고 말하였습니다.

플라나리아 슈미테아 메디테라네아 내 두 배설계 표지의 이중 형광(빨간색 및 녹색) 현지내 교배.

결론

Olympus VS200 연구용 슬라이드 스캐너는 슈미테아 메디테라네아 같은 매우 두꺼운 샘플의 고해상도 형광 이미지를 캡처합니다. TruSight Live 및 Z 스택 기능은 연구원이 이러한 두꺼운 샘플의 미세한 세부사항을 관찰하고 분석하는 데 도움이 되는 필수적 기능입니다.

감사의 말

이 애플리케이션 노트는 다음과 같이 독일 작센 드레스덴의 Max Planck 분자세포 생물학 및 유전학 연구소의 연구원들과 독일 뮌스터의 Olympus Soft Imaging Solutions의 응용 전문가인 Dr. Daniel Göttel의 도움으로 작성되었습니다.

• 독일 작센 드레스덴의 Max Planck 분자세포 생물학 및 유전학 연구소의 박사 후 연구원인 Dr. Tobias Boothe
• 독일 작센 드레스덴의 Max Planck 분자세포 생물학 및 유전학 연구소의 박사 후 연구원인 Dr. Miquel Vila-Farré
• 독일 작센 드레스덴의 Max Planck 분자세포 생물학 및 유전학 연구소의 박사 후 연구원인 Dr. Hanh Vu
• 독일 뮌스터의 Olympus Soft Imaging Solutions의 응용 전문가인 Dr. Daniel Göttel

참고문헌

*Nature; 2018년 1월24일(DOI: 10.1038/nature25473).