FLUOVIEW FV3000 현미경을 사용해 세정된 쥐 간의 3D 관찰
간의 고해상도 3D 관찰
두꺼운 조직 표본의 3D 관찰에는 조직 샘플 내부 관찰 시 발생하는 빛 흡수 및 산란의 증가로 인해 일반적으로 이광자 현미경이 필요합니다. 일반적으로 간은 높은 빛의 산란을 일으키는 조직이지만 적절한 광학계와 투명화 방법을 사용하면 FV3000 컨포칼 현미경으로 두꺼운 조직의 3D 관찰이 가능합니다. 이 실험에서 개구수(NA)가 1.05이고 작동 거리(WD)가 0.8mm인 Olympus 30x 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 세정된 쥐 간 샘플 내 담도계를 고해상도 3D로 관찰할 수 있었습니다.
실험 요약
쥐 간 조직 표본의 광학 투명화
쥐에서 수집된 간 조직 |
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면역 염색으로 형광을 위해 조직을 착색합니다 |
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SeeDB를 사용하여 간 조직을 투명화 합니다 |
데이터 제공: K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima, and T. Itoh, "Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling," Elife, 2016 Jul. 19;5, pii: e15034, doi: 10.7554/eLife.15034.
3D로 복잡한 담도망을 시각화하기 위한 실험 프로토콜. 조직 수집 후 담즙 조직에는 3D로 복잡한 담도망을 시각화하기 위해 면역 염색이 적용됩니다. 그런 다음 면역 염색된 표본을 SeeDB1)를 사용하여 투명화 합니다.
1) 참고문헌: Ke MT, S. Fujimoto, and T. Imai, "SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction," Nat Neurosci, 2013 Aug; 16 (8): 1154–61, doi: 10.1038/nn.3447, Epub 2013 Jun. 23, PMID: 23792946
20x 대물렌즈(UPLSAPO20X (NA: 0.75, WD: 0.6 mm))로 손상된 쥐 간의 담도계 구조의 3D 관찰
 | 실험의 목적은 손상된 쥐 간에서 담도계 줄기의 길이 및 두께를 정량적으로 측정하는 것이었습니다. 샘플의 최초 스크리닝을 위해 FV3000에 20x 건식 대물렌즈를 사용하여 200µm 두께의 세정된 간 조직 표본에서 담즙 조직(녹색, 담도 상피 세포 표지 CK19)의 연속적인 광시야 단층촬영 이미지를 획득하였습니다. 이 설정을 통해 많은 샘플에 대해 효과적인 정량적 관찰을 수행할 수 있었으며 고해상도에서 검사할 샘플을 빠르게 찾을 수 있었습니다. 위의 이미지에서 기준자는 100µm을 나타냅니다. |
30x 대물렌즈(UPLSAO30XS (NA: 1.05, WD: 0.8 mm))로 쥐 간의 담도계 구조의 3D 관찰
 대조 표준 쥐 |  Klf5-LKO 쥐 |
관련 영상동영상: 대조 표준 쥐의 담도계 구조 | 고해상도 3D 이미지를 획득하기 위해 FV3000 현미경 및 Olympus 30x 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 SeeDB로 투명화된 200µm 두께의 간 조직에서 담즙 조직(녹색, 담도 상피 세포 표지 CK19)의 연속적인 단층촬영 이미지(1µm의 Z 축 간격)를 획득하였습니다. 이 결합을 통해 광시야를 유지하면서 대조 표준 및 Klf5-LKO 쥐의 담도계를 고해상도로 관찰할 수 있었습니다. Klf5-LKO 쥐에서 연구원들은 담도계에서 공간적으로 분리된 CK19+ 세포 클러스터(흰색 화살표)를 관찰하였습니다. |
Dr. Okada의 견해:
복합 담도계 구조의 3D 시각화 및 미세 조직 분석
Dr. Hajime Okada | 이 실험에서는 식이성 간 손상 후 간 리모델링 관련 담도계의 3D 구조를 분석하였습니다. FV3000 현미경을 사용하여 Klf5-LKO 쥐와 대조 표준 쥐에서 세정된 간 조직의 담도계 구조를 비교하였습니다. 현미경의 고감도 검출기를 통해 높은 해상도와 밝기를 가지는 이미지의 획득과 동시에 고속 관찰이 가능하여 정량 분석이 가능한 수준의 이미지가 획득되었습니다. 또한 Olympus 실리콘 오일 이멀젼 대물렌즈를 통해 조직 내부에서도 선명한 이미징이 가능하여 담도계에서 공간적으로 분리된 CK19+ 세포 클러스터를 찾을 수 있었습니다. 이 결과는 간 손상의 다양한 조건에서 조직 리모델링의 담도계 구조가 일부 분자 메커니즘에 의해 조절될 수 있음을 시사합니다. |
Dr. Itoh의 견해:
투명화된 간의 3D 이미징2)
Dr. Tohru Itoh | 현재까지 간에 대한 의학 및 생화학 연구는 온전한 전체 장기 대신에 조직 부분을 사용한 2D 관찰 방법에 주로 의존하였습니다. 하지만 이러한 방법으로는 생리학적 조건과 다양한 간 질병 조건에서 간의 “본색”을 검출하고 이해하기 어렵습니다. 우리 연구 그룹은 간 조직의 착색 및 투명화를 위한 새로운 시각화 기술을 개발하였으며 이를 통해 온전한 쥐 간 내 담도계 조직의 3D 관찰을 최초로 성공적으로 수행하였습니다. 투명화 및 착색 기술의 결합으로 동적 담도계 구조 변화(담도계 리모델링)를 검출하고 조절 메커니즘 및 생리학적 기능에 대한 연구를 수행할 수 있었습니다. 위에 제시된 실험에서는 SeeDB 투명화 시약 및 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 담도계 구조의 효과적 시각화를 위한 실험 시스템을 성공적으로 설정하였습니다. FV3000 현미경을 사용하여 담도계 리모델링의 분자 메커니즘의 일부가 밝혀졌습니다. 여기서 제시된 기술과 함께 컨포칼 현미경은 담도계 구조를 포함한 간 내 다양한 조직 및 세포의 동적 변화의 3D 분석에 유용합니다. 우리의 새로운 시각화 기술이 조직 리모델링 및 세포 간 상호작용의 견지에서 개발 및 재생의 과정에 대한 이해 증진을 통해 간 질환과 재생 의학의 진단 및 치료법 개발에 기여할 수 있기를 기대합니다. 2) 참고문헌: K. Kamimoto, K. Kaneko, CY. Kok, H. Okada, A. Miyajima, and T. Itoh, "Heterogeneity and stochastic growth regulation of biliary epithelial cells dictate dynamic epithelial tissue remodeling," Elife, 2016 Jul. 19;5, pii: e15034, doi: 10.7554/eLife.15034. K. Kaneko, K. Kamimoto, A. Miyajima, and T. Itoh, "Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis," Hepatology, 2015 Jun.;61(6):2056-66, doi: 10.1002/hep.27685, Epub 2015 Apr. 22. |
FV3000 컨포칼 현미경에 의한 실험 촉진 방법
전체 스펙트럼 시스템이 고감도를 제공합니다
FV3000 시리즈는 VPH(Volume-Phase Holographic) 기술을 사용하여 투과되는 빛을 회절시키는 Olympus의 TruSpectral 검출 기술을 이용합니다. 이 기술은 반사 유형 격자가 장착된 기존 스펙트럼 검출 장치와 비교하여 빛 처리량이 훨씬 더 높으며 심도 있는 조직 관찰에 필요한 레이저 파워를 최소화합니다.
라이브 셀 이미징용 실리콘 이멀젼 대물렌즈가 심도 있는 고해상도 관찰을 제공합니다
실리콘 오일의 굴절률(ne≈1.40)은 살아있는 조직의 굴절률(ne≈1.38)에 가까우므로 굴절률 불일치에 의해 야기된 최소 구면 수차로 살아있는 조직 내 심도 있는 관찰을 가능하게 합니다. 또한 실리콘 오일은 고갈되거나 경화되지 않으므로 오일을 재충전할 필요가 없으며 연장된 타임 랩스 관찰에 이상적입니다.
감사의 말
이 애플리케이션 노트는 다음 연구원들의 도움으로 작성되었습니다.
국립 유전학연구소 유전자변형연구센터 포유류발달과(Division of Mammalian Development, Genetic Strains Research Center, National Institute of Genetics) Dr. Hajime Okada
도쿄 대학 정량적 생명과학 연구소(Institute for Quantitative Biosciences) 줄기세포치료실험실 프로젝트 부교수 Dr. Tohru Itoh
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