FLUOVIEW FV3000 공초점 현미경 및 X 라인 40X 오일 침지 대물렌즈를 사용한 골세포 상호작용의 고해상도 이미징
뼈는 파골세포 골흡수와 골아세포 골형성의 균형을 이용하여 재생성됩니다. 하지만 특정 건강 요인으로 인해 불균형이 야기되어 골다공증 같은 골질환에서 취약골을 초래할 수 있습니다. 골 재생성의 메커니즘을 이해하려면 파골세포와 골아세포 간의 상호작용을 관찰하는 것이 중요합니다.
본 연구에서는 쥐의 경골 횡단면(그림 1)을 준비하였으며 골수와 피질골 간 경계 영역 내 파골세포와 골아세포를 면밀히 관찰하였습니다. 이렇게 하려면 관심 영역을 광시야를 캡처하기 위한 저배율 대물렌즈 사용이 일반적으로 필요하며 뒤이어 더 높은 해상도로 세부사항을 관찰하기 위해 고배율 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용해야 합니다. 하지만 대물렌즈를 교체하면서 관심 영역을 놓칠 수 있기 때문에 이러한 방법은 어려울 수 있습니다.
여기서 광시야에서 관심 영역을 찾아냈으며 대물렌즈를 교체하지 않고 40X 오일 이멀젼 대물렌즈만을 사용하여 미세 구조를 고해상도로 관찰하였습니다.
그림 1: 경골 횡단면
X 라인 40X 오일 이멀젼 대물렌즈(UPLXAPO40XO)를 사용한 골세포 상호작용의 고해상도 이미징
혈관 내피 세포(노란색)와 골아세포(녹색)의 접촉 영역(그림 2a의 *)과 파골세포(빨간색)와 골아세포의 상호작용 영역(그림 2a의 #) 뿐 아니라 쥐 경골 횡단면의 골수와 피질골 간 경계 영역을 관찰하였습니다. 40X 오일 대물렌즈의 광시야를 통해 고배율 이미지가 오버뷰 이미지에 위치해 있는 곳을 보여주는 이미지를 획득할 수 있었습니다(그림 2a의 삽도).
스캔줌을 사용하여 파골세포와 골아세포의 상호작용 영역을 면밀히 관찰할 수 있었습니다(그림 2b). X 라인 UPLXAPO40XO 대물렌즈를 사용하여 획득된 이미지 품질은 UPLSAPO60XO 기존 대물렌즈를 사용하여 획득된 이미지 품질과 거의 동일하였습니다(그림 2c).
그림 2: 쥐 경골 횡단면의 형광 이미지
UPLXAPO40XO 대물렌즈와 1x 스캔 줌을 사용하여 획득한 이미지
UPLXAPO40XO 대물렌즈와 3.45x 스캔 줌을 사용하여 획득한 이미지
UPLSAPO60XO 대물렌즈와 2.03x 스캔 줌을 사용하여 획득한 이미지
이미징 조건
현미경: FV3000 시스템
대물렌즈: UPLXAPO40XO(참조로 사용된 UPLSAPO60XO)
레이저: 488nm(Alexa Fluor 488, 녹색), 561nm(Alexa Fluor 568, 빨간색), 640nm(Alexa Fluor 647, 노란색)
FV3000 컨포칼 현미경에 의한 실험 촉진 방법
X 라인 대물 렌즈가 탑재된 고성능 이미징
X 라인 대물렌즈의 높은 개구수(NA)를 통해 더 밝고 더 높은 해상도 이미지를 위해 더 많은 빛을 모을 수 있습니다. |  |
낮은 여기광 하에서 높은 신호 대 잡음비(SNR) 이미지 획득
| 독자적인 스펙트럼 검출 기술을 사용하는 FV3000 컨포칼 현미경의 TruSpectral 검출기는 고감도와 스펙트럼 유연성을 결합하여 희미한 형광단도 검출합니다. TruSpectral 검출기는 최대 45% 양자 효율로 GaAsP 광전자 증배관(PMT)의 4개 채널까지 포함하며 이를 통해 기존 장비로 볼 수 없을 정도로 너무 희미한 샘플을 볼 수 있습니다. Peltier 냉각은 매우 낮은 여기광 하에서 높은 SNR 이미지에 대해 배경 잡음을 20% 줄여줍니다. |  |
Dr. Yukiko Kuroda의 견해
| 광시야용 저배율 건식 대물렌즈와 고해상도 이미징용 UPLSAPO60XO 대물렌즈 간 교환 시 파골세포와 골아세포 상호작용의 고해상도 이미징 중에 상호작용 영역을 찾는 것이 어려웠습니다. 또 하나의 어려운 점은 이미징 과정 중 오일을 첨가하는 것이었습니다. 전체 이미징 과정에 대해 UPLSAPO60XO 대물렌즈 사용 시 협시야로 인해 관심 영역을 찾아내는 데 오랜 시간이 걸렸습니다. 본 연구에서는 상호작용 영역을 찾아내는 데 성공하고 UPLSAPO60XO와 동등한 높은 개구수(NA)의 40X 오일 이멀젼 대물렌즈(UPLXAPO40XO)만을 사용하여 UPLSAPO60XO 대물렌즈로 캡처된 것과 동등한 고해상도 이미지를 획득할 수 있었다는 것을 입증합니다. 그 결과, UPLXAPO40XO 대물렌즈만을 사용하여 파골세포와 골아세포 간 상호작용을 효율적으로 관찰할 수 있었습니다. |
감사의 말
이 애플리케이션 노트는 Dr. Yukiko Kuroda의 도움으로 작성되었습니다. 게이오 대학의 강사로서 본 연구에서 이미지에 대한 책임을 맡았습니다.
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