약물 스크리닝 프로세스 자동화—암 스페로이드 준비부터 3D 이미징 분석까지

요약

Yamaha의 CELL HANDLER™ 자동화 세포 선택 및 이미징 시스템을 Evident의 FLUOVIEW™ FV3000 공초점 레이저 스캐닝 현미경 및 NoviSight™ 소프트웨어와 결합하면 암 스페로이드 약물 스크리닝 워크플로 거의 전체를 자동화할 수 있습니다(그림 1). 여기에는 샘플 준비 단계부터 3D 이미지 분석까지의 작업이 포함됩니다. 워크플로를 자동화하면 많은 수의 3D 세포 모델을 사용하여 안정적이고 효율적인 방식으로 분석을 실행할 수 있습니다.

그림 1. 자동화된 암 스페로이드 약물 스크리닝 워크플로

서론

3차원 암 스페로이드를 사용하여 약물의 효과를 평가하는 것은 중요합니다. 스페로이드는 2차원 모델보다 훨씬 더 정확하게 암의 복잡한 생체 내 미세 환경을 반영하기 때문입니다. 그래서 연구자들은 종양의 미세 환경과 매우 유사한 조건에서 약물의 효과를 평가할 수 있습니다.

그러나 여러 샘플을 준비하고, 염색하고, 이미징하고, 3D로 분석하려면 시간이 너무 많이 듭니다. 이러한 워크플로를 간소화하기 위해 우리는 Yamaha CELL HANDLER™로 스페로이드 준비, 고정 및 염색을, 그리고 FV3000 시스템 및 NoviSight™ 소프트웨어로 이미지 획득 및 3D 분석을 자동화했습니다.

장점

• CELL HANDLER는 세포 손상이나 샘플 손실 없이 샘플 준비를 가능하게 합니다. 또한, 샘플 이동 전과 후에 스페로이드 이미지를 촬영하며, 완전한 추적 가능성을 제공하기 위해 다양한 매개변수를 분석합니다.
• FV3000 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 NoviSight 소프트웨어는 여러 샘플에 대해 3차원 분석을 쉽게 수행할 수 있습니다. 스페로이드 내부 및 외부에서 약물이 끼치는 영향의 차이를 정량화할 수 있습니다.

방법

암 스페로이드 샘플 준비

첫째, 초저 장착 U자형 바닥 플레이트에 직경이 100µm인 스페로이드가 생성되고, 2nM의 Paclitaxel(PTX) 또는 DMSO으로 처리되었습니다. 3일간 배양 후, 스페로이드는 ReadyProbe™ 세포 생존 이미징 키트(녹색/파란색)로 염색되고, 고정 용액과 함께 플레이트로 옮겨진 후 하룻밤 동안 4℃에서 처리되었습니다. 그 다음, 세포는 SCALEVIEW-S4로 옮겨지고 하룻밤 동안 37 °C에서 처리되었습니다. 모든 샘플 이동은 Yamaha CELL HANDLER로 수행되었습니다.

웰 플레이트에서 스페로이드 이미징 그리고 3D 분석

플레이트에 있는 스페로이드의 형광 이미지 여러 개를 획득하는 데 FV3000 공초점 스캐닝 레이저 현미경이 사용되었습니다. 이미징 데이터를 NoviSight 3D 세포 분석 소프트웨어로 가져왔습니다. 이 소프트웨어는 3D 이미지에서 살아 있는 세포와 죽은 세포를 인식하고, 각 웰의 생존율을 정확하게 계산했습니다.

결과

Yamaha CELL HANDLER™에서 이미징 및 분석 수행

CELL HANDLER는 샘플 이동 전과 후에 이미지 및 형태 데이터를 획득할 수 있습니다. 이미지는 대부분의 스페로이드가 샘플 손실 없이 성공적으로 이동된 것을 보여주었습니다(그림 2).

그림 2. 염색 및 고정 작업 중 스페로이드

PTX로 처리된 스페로이드와 처리되지 않은 스페로이드 사이에 영역 차이는 관찰되지 않았습니다. 반면, 형광 신호에 따르면 PTX는 HT-29에서 살아 있는 세포 수를 대폭 감소시켰지만, HCT-15 스페로이드는 감소시키지 않았습니다(그림 3).

그림 3. 스페로이드 영역 및 세포 생존, N=6, **: p < 0.01, 오류 막대: SE

FV3000 CLSM 시스템 및 NoviSight 소프트웨어를 사용한 3D 이미지 획득 및 분석

PTX가 스페로이드 미세 환경에 끼치는 영향을 분석하기 위해 FV3000 현미경으로 스페로이드를 관찰했습니다(그림 4).

그림 4. FV3000 현미경으로 획득한 이미지, 파란색: 핵(모든 세포), 빨간색: 핵(죽은 세포)

그 다음, 여러 3D 이미지가 3D 분석을 위해 NoviSight 소프트웨어에 로드되었습니다. 분석을 통해 PTX가 HT-29 스페로이드의 생존 세포 수를 대폭 감소시켰으며, 중앙에서 내부까지 스페로이드에 큰 영향을 준 것을 알 수 있었습니다. 반면, HCT-15 스페로이드에 끼친 영향은 더 적었습니다(그림 5).

그림 5. 3D 이미징 분석을 통해 알아본 세포 생존, N=3~6, **: p < 0.01, 오류 막대: SE

결론

Yamaha CELL HANDLER는 많은 수의 스페로이드 샘플 준비를 간소화합니다. FV3000 현미경과 NoviSight 소프트웨어를 사용하여 샘플을 쉽게 3차원으로 분석할 수 있습니다. 이처럼 자동화된 워크플로가 제공하는 높은 추적 가능성을 통해 3D 세포 분석의 정확성을 향상할 수 있습니다.

작성자

Hiroya Ishihara, EVIDENT, 생물공학, 연구 및 개발