다모드 이미징과 형광 다중화는 하나의 실험에서 샘플의 각기 다른 요소를 효율적으로 조사하는 기본적 방법이 되었습니다. 하지만 이 실험의 정량적 결과는 풍부한 이미지 데이터를 추출하는 능력, 이 한 가지에 달려 있습니다.
정량화를 위한 전체 슬라이드 이미징의 중요성
전체 슬라이드 이미징의 기본 원칙은 작은 시야의 고배율 이미지들을 샘플의 더 큰 오버뷰 안에 디지털 방식으로 모으는 것입니다. 이렇게 하는 이유는 무엇인가요?
간단히 말해서, 때때로 디지털 슬라이드 이미징 또는 가상 현미경이라고 하는 전체 슬라이드 이미징의 파워가 현미경 이미지에 더 완벽한 생물학적 맥락을 주기 때문입니다. 고배율로 고립 상태의 한두 세포를 보는 것이 유익할 수 있지만, 그 세포를 전체 조직의 더 큰 맥락에서 볼 경우 조사의 더 큰 수단을 얻을 수 있습니다.
그러면 그냥 조직의 거시적 이미지를 촬영하지 않는 이유는 무엇인가요? 전체 슬라이드 이미징의 파워는 조직 전체에 걸쳐 핵을 계수하거나 뇌의 장거리 축색돌기를 추적하는지 여부와 상관없이 현미경 해상도가 이미지의 더 큰 정량화를 가능하게 하는 매크로 투 마이크로 보기입니다.
해상도와 생물학적 맥락의 이러한 강력한 결합 때문에 자동 전체 슬라이드 이미징은 많은 연구 프로그램의 초석이 되었습니다. 샘플에서 새 정보를 추출하기 위한 강력한 관찰 능력에 대한 내용을 알아보려면 끝까지 읽으십시오.
자동 전체 슬라이드 스캐닝 시스템의 이미징 역량
수년간 전체 슬라이드 이미징 시스템은 이미징 모드에서 제한되었습니다. 현재, VS200 연구 슬라이드 스캐너 같은 자동 전체 슬라이드 이미징 시스템은 여러 관찰 방법들을 결합하여 특정 조건에서만 보이는 구조를 볼 수 있게 해줍니다. 즉 다음과 같이 관찰 방법을 짜맞출 수 있습니다.
- 명시야: 명시야 이미징에서, 투과된 백색광은 샘플을 관통하며 조직은 발색 염색을 통해 시각화됩니다. 하지만 명시야는 헤마톡실린 및 에오신 같은 발색 염색을 사용하지 않는 한 선천적 대비를 제공하지 않습니다.
- 에피 형광: 특정 항체 표지 및 더 높은 정도의 분자 표적화를 가능하게 합니다. 또한 더 많은 염색의 오버레이를 허용하여 다중화의 분야를 확대시킵니다.
- 위상차 및 편광: 위상 광학 및 편광이 전체 슬라이드 이미지에 포함될 수 있으며 위상 링 조명 또는 편광에 따라 다양한 수준의 선천적 대비를 제공합니다.
- 암시야: 조직의 막 구조에서 굴절률 차이를 사용합니다. 일부 염색이 암시야를 강화할 수 있지만, 이 방법은 완전히 무표지일 수 있으며 형광에 필적할 만한 수준의 대비를 제공합니다. 하지만 이러한 관찰 모드는 먼지에 민감할 수 있습니다.
파라마운트 고환, 비착색됨, 20X 대물렌즈로 캡처됨. 명시야(상단 좌측), 형광(상단 우측), 암시야(하단 좌측), 편광(하단 우측). 이미지 데이터 제공: Robin Wacker, Günthersleben, 독일.
하지만 이것이 전부가 아닙니다. 최신 가상 슬라이드 스캐너에 기타 이미징 도구가 딸려 있어 실험에서 더 나은 데이터를 추출할 수 있습니다. 예를 들어 VS200 슬라이드 스캐너는 조직의 다중 평면을 통해 초점을 맞추어 다음 결과를 얻을 수 있습니다.
- 최고 해상도로 다중 평면 획득
- 최대 100µm 두께의 샘플 이미지 획득
- 가능한 모든 관찰 방법을 이용하여 이미지 캡처
- 샘플의 모든 차원에서 정보를 쉽게 입수
- 투영 계산(디콘볼루션, 최대 Z 또는 EFI)
Z 스태킹은 최고 해상도로 최대 35평면을 획득할 수 있으므로 샘플의 모든 차원에서 정보를 얻기 용이합니다
또 하나의 유용한 도구는 시스템이 최고 해상도를 얻을 수 있도록 해주는 자동 오일 분배 장치입니다.
이러한 다양한 이미징 모드와 기능의 결합은 항체 표지 기법에 의해 제공된 분자 특이성과 함께 사용될 경우 훨씬 더 강력합니다. 하지만 형광을 사용하여 효율적으로 정량적으로 표지하는 것이 여전히 어려울 수 있습니다.
이러한 점을 염두에 두고 다음 섹션에서는 형광 다중화 용도에 도움이 될 수 있는 이미징 기술을 살펴봅니다.
조직 다중화를 위한 기술 요점
형광 다중화는 믿을 수 없을 정도로 복합적인 종양 미세환경으로 인해 면역 종양학 연구의 유용한 도구가 되었지만, 분석을 제대로 작동시키고 관심 종양에 적용하려면 전문 소프트웨어, 요원 및 장비가 필요합니다.
제조업체들은 이런 유형의 분석이 널리 사용되는 것을 막는 다양한 요구 및 문제들을 처리하는 새 기술을 개발하였습니다. 이러한 기술적 필수 사항에는 다음이 포함됩니다.
다음을 처리하는 고수준 다중화:
| 다음을 제공하는 워크플로 호환성:
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다음을 캡처하는 슬라이드 이미징:
| 복잡한 표현형을 식별할 수 있는 소프트웨어:
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UltiMapper™ 다중화 생물지표 분석의 개요
다중화된 이미징 실험을 위한 또 하나의 유용한 기술은 UltiMapper I/O 분석입니다.
UltiMapper I/O 분석은 InSituPlex® 기술을 이용하여 생물지표 활동의 세포 표현형 및 공간적 프로파일링을 위한 전체 슬라이드 고해상도 다중화를 가능하게 할 수 있습니다. 사전 최적화된 시약 기반 솔루션인 이들 키트는 면역 조직 화학(IHC) 워크플로 전체에 걸쳐 기존 장비 및 소프트웨어에 원활하게 통합되며 연구원들이 하루 만에 염색에서 시작하여 이미지 획득 및 평가를 완료할 수 있게 합니다.
아래 이미지는 간단한 4단계 프로세스를 보여줍니다.
1단계: 회수:
- 평소대로 탈랍 및 회수
2단계: 염색
- 단일 염색 단계에서 바코드된 항체 혼합물로 샘플 배양
- 각 항체에 부착된 고유 DNA 염기순서(바코드)
3단계: 증폭
- 모든 표적을 동시에 증폭
- 각 항체의 바코드비율을 늘려 더 많은 보완 프로브 가닥이 결합되게 함
4단계: 검출
- 표적이 결합되도록 보완 형광 DNA 프로브를 추가
- 샘플의 이미지 획득 준비 완료
- DNA 교배 기술
정량화를 위한 이미지 품질에 영향을 미치는 3가지 요소
실험 설계 시 광학 및 염색 기술의 올바른 결합이 최적의 다운스트림 분석으로 이어진다는 것을 유념합니다. 불량 시약 세트나 잘못된 획득 및 광학 구성에서 비롯된 저품질 이미지의 분석에서는 제대로 된 분석 결과를 얻을 수 없습니다.
다음은 정량화를 위한 이미지 품질에 영향을 미치는 3가지 광학 요소입니다.
- 정확한 조명 색: H&E 염색에서 재현 가능한 트루 컬러를 표시하는 것이 중요합니다. 투과 광학체는 자주색, 청록색 및 분홍색을 재현하도록 할로겐 광원을 모방하는 스펙트럼 특성을 가져야 합니다.
VS200 시스템의 투과 조명을 위한 트루 컬러 LED는 할로겐 램프와 동일한 스펙트럼 특성 및 출력을 가지므로 자주색, 청록색 및 분홍색 염료가 정확히 표시, 이미징 및 렌더링됩니다.
- 색 충실도 및 정밀성: 올바른 조명 스펙트럼 특성의 구비 외에 현미경 카메라의 색 충실도 및 정밀성이 우수해야 합니다. 올바른 밸런스로 색 보정된 카메라를 사용하여 조직을 정확히 나타내야 합니다. 획득 설정이 다를 경우 이미지 결과가 다르게 나오는 것처럼 디지털 이미지를 응시하는 것은 주관적일 수 있지만, 색 보정된 카메라 및 ICC 프로파일은 컴퓨터 모니터에 뛰어난 색 및 강도를 복제합니다.
획득 설정이 다를 경우 이미지 결과가 다르게 나오는 것처럼 디지털 이미지를 응시하는 것은 주관적일 수 있습니다. VS200 스캐너는 색 보정된 카메라를 사용하며 컴퓨터 모니터상의 뛰어난 색 및 강도 재현을 위한 ICC 프로파일을 제공합니다.
- 시야의 평탄도: 시야가 평탄하지 않거나 보정이 내장되지 않은 일련의 이미지를 캡처할 경우 모든 시야에 정량화의 문제로 이어지는 후광 효과가 야기될 수 있습니다. 이 경우 모든 시야의 비선형 밸런싱 및 필터링을 사용해야 하며 시간과 리소스가 소요됩니다. 정량적 결과의 개선을 위해 시야의 평탄도를 최대화하도록 광학 구성을 고려합니다.
VS200 연구 스캐너의 고성능 X 라인™ 대물렌즈가 이미지 평탄도를 향상시킵니다.
마무리
이미지는 다중 초점 Z 스택을 사용하여 대량으로 획득될 수 있기 때문에 이미지에 대한 최상의 초점을 선택할 수 있게 해주는 디콘볼루션, 최대 강도 투영 또는 연장된 초점 보기 같은 방법을 사용하여 이미지의 대비를 향상시키고 강화할 수 있습니다.
결국 정량적 분석의 솔루션은 생물학적으로 관련된 통계 정보를 수집하며 분할 분석에 필요한 정도로 강건한 소프트웨어를 비롯하여 우수한 표지와 우수한 광학체가 결합된 것입니다.
다모드 이미징 및 형광 다중화 실험에서 풍부한 데이터 추출에 대해 자세히 알아보려면 on-demand webinar here로 채널을 맞추십시오.
