蛍光定量イメージングの信頼性を向上する顕微鏡性能モニター技術

はじめに

蛍光顕微鏡イメージングは形態観察だけでなく、定量的な分析と評価にも使われるようになっています。しかし、蛍光画像を定量的な分析と評価に用いる際には、顕微鏡の定期的なメンテナンスが推奨されています。なぜなら、外部環境の温度変化により、光源本体の出力が変動することがあるためです。また、カップリング光学系が熱膨張によりわずかに変形することで、対物レンズから出射される実際のレーザーパワーが変動することもあります。ですが、このメンテナンスには専門的な知識と技術が求められます。顕微鏡の性能を管理することは、実験の再現性を高め、研究の質を上げるために重要な課題とされており、研究者や共用施設での顕微鏡を管理する人々の間で活発に議論されており^1,2,3、2021年にはNature Methodsで再現性に関する報告の特集が組まれました⁴。さらには、ISO（国際標準化機構）においても、2019年にISO 21073が公開され、共焦点レーザー走査型顕微鏡の画像性能についても規定されました⁵。

エビデントは、高い定量性、高い再現性を実現する共焦点レーザー走査型顕微鏡 FLUOVIEW FV4000をリリースしました。そして今回、管理者の負担を減らしつつ、蛍光定量時に変動しうる３つの性能をモニターするソリューション「顕微鏡性能モニター (MPM : Microscope Performance Monitor)」を新たに提案します。本稿では、蛍光画像を用いて定量解析する研究者が、日常的に管理すべき性能を提案し、それら性能のそれぞれの測定原理、メンテナンスが必要となる判定基準、および変動が画像に及ぼす影響について紹介します。
 

蛍光定量イメージングにおいてモニターすべき性能

2022年、O. Faklaris et al.は光学顕微鏡を用いたイメージングの品質管理において、７つの定期的にチェックすべき顕微鏡性能と、熟練した顕微鏡ユーザー向けのそれぞれの性能の測定プロトコルのガイドラインに関して提言されました 。７つの性能とは、①照射パワーの安定性、②結像性能、③視野照明のフラットネス、④色収差、⑤ステージドリフト、⑥ステージ位置の再現性、および⑦検出器の背景ノイズです。しかし、初心者の顕微鏡ユーザーにとっては、これらの性能を自ら測定するのは困難であり、顕微鏡の定期的なメンテナンスは、共用施設の管理者にとって大きな課題でした。エビデントは、ファーストステップとして、管理者が直面する課題を軽減するため、ユーザーでも簡単に蛍光シグナルを定量的に測定し、定量蛍光イメージングの再現性を担保できるソリューションの開発に着手しました。蛍光シグナルの変動は、共局在観察時の色収差やタイムラプス中のステージドリフトと違い、画像の見た目では判断するのが難しく、研究者が性能の変動に気づかない可能性が高いためです。この性能の変動に気づかずに研究を進めてしまい、誤った研究成果が導かれることを防ぐことがこのソリューションの狙いの一つでもあります。仮に、光源の強度が変動していることに気づかずに、その結果を使って研究論文を執筆してしまった場合、研究は実験準備の段階まで後戻りをしてしまうことになります。

蛍光顕微鏡の明るさはメンテナンスすべき７つの性能のうち、「照射パワー」、「結像性能」、「検出器」の３つに大きく依存します。蛍光の明るさは、サンプルに照射した光の強さと、発生した蛍光をどれだけ検出できるかによって決まるためです。ここからは、上記3つの性能に依存する理由を以降の文章で補足しながら、顕微鏡性能モニターでチェックできる3つの性能に言い換えていきます。最初に、サンプルに照射した光の強さは、「レーザーパワー」と照射領域によって変動します。照射領域は、レーザー光の集光性能、すなわち「結像性能」によって決まるので、結像性能の変動によって、サンプルに照射した光の強さは変わります。次に、蛍光をどれだけ検出できるかについては、システム全体の「検出感度」に依存します。よって、「レーザーパワー」,「結像性能」そして「検出感度」の3つの性能が時間と共にどのように変化するかをモニターすることで、蛍光定量イメージングの品質と一貫性を保つことができ、研究の後戻りを防ぐことが可能です。

「レーザーパワー」をモニターすべき理由は、対物レンズから出射されるレーザーパワーが、外部環境の温度変化によって変動するためです。レーザーパワーはFV4000のスキャナーユニット直後の位置で測定し、顕微鏡を設置した時の対物レンズから出射されるレーザーパワーがどれだけ変動したかを相対的に把握します。その後上記相対値を踏まえてレーザー本体の出力値を調整することにより、対物レンズから出射されるレーザーパワーが同じ値になるよう補正します。これによって、サンプルに照射されるレーザーパワーが常に一定に保持されます。

「検出感度」をモニターすべき理由は、顕微鏡を設置した時からの検出光学系の劣化やピンホールの光軸ズレによる検出効率の低下を定量的に把握するためです。特に、レーザー顕微鏡に必須であるピンホールは、季節変化によって室温が大きく変わると、その中心位置が変わります。温度が一定の環境に設置されていればモニターする必要はありませんが、すべての共焦点レーザー走査型顕微鏡が、温度が一定に保たれる環境に設置されるわけではありません。また、頻度は低いですが、レンズ表面のゴミや傷によっても、光の透過率が落ちてしまい、これらは徐々に変化するためユーザーが気づきにくい性能です。

「結像性能」は、主に対物レンズの傷、汚れ、イマージョン液のつけ間違い、補正環の調整ミスなどの誤った使い方によって変動します。顕微鏡の知識がなければ、特に気づきにくい性能です。また、対物レンズの落下衝撃による内部レンズの傾きや破損によって結像性能が劣化してしまった場合、ユーザーは管理者に報告することによる不利益を恐れ、問題が発覚しにくいということもあり得ます。いずれも、対物レンズの使用頻度に応じて発生する変動です。そのほかに結像性能を劣化させる要因として、顕微鏡筐体に組み込まれたミラーやレンズなどが温度によって、光軸ズレを起こしてしまうケースもあります。
 

顕微鏡性能モニターの性能測定の原理

３つの性能の測定は独立に行なわれます。それぞれの測定原理について説明します。

レーザーパワー

顕微鏡性能モニターでのレーザーパワーの測定系の概要を図１に示します。測定のフローは以下の通りです。測定を開始するだけで、システムが自動で以下のフローを実施します。

1) 405nmレーザーパワーを100%に設定し、その他のレーザーパワーを0%に設定。

2) 設定されたレーザーを出射

3) 照射されたレーザーの一部が、FV4000のファイバー導入直後に設置されたビームスプリッター（BS）に反射。

4) FV4000内部に設置されている光検出器（LPM: Laser power monitor）にレーザーが入力。

5) LPMの出力値から、実際に100%で出力されたレーザーパワーを算出。

6) 出射されたレーザーを0%に設定し、次の短波長のレーザーを100%に変更。
1)～6)を設置されている全レーザーに対して順番に実施。

_{図１．レーザーパワー測定系の概要}

レーザーパワーの補正は、LPMで測定した値を用いて行ないます。まず、設置時のレーザー出力と現在の出力を比較し、その差異を割合で算出します。次に、算出された割合に基づいてレーザーの制御パラメータを調整します。これにより、レーザー出力を一定に保ちます。また、この補正は画像取得のたびに行なうことを推奨し、本ソリューションでは、画像を取得するごとに自動で測定と補正を実施することができ、常に一定に保たれたレーザー出力で画像を取得できます。

測定したレーザーパワーが、実際のサンプルに照射されている光の強さとどの程度一致するかを確認するため、顕微鏡性能モニターで計測したレーザーパワーと対物レンズから出射されるレーザーパワーを６か月間追跡し、その変化を記録しました。その結果を図２に示します。対物レンズから出射されるレーザーパワーの測定には、この測定専用の対物レンズUPLSAPO10Xを用いました。図２から分かるように、顕微鏡性能モニターで計測したレーザーパワーと対物レンズから出射されるレーザーパワーとの間には高い相関関係が見られ、その精度は5％以内であることが確認されました。

一方で、レーザー設定値が低い場合、装置が十分にウォームアップされていなければ、対物レンズから出射されるレーザーパワーは安定しません。図３は、装置の起動後２時間にわたるウォームアップの様子を示しています。1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%という６つの異なるレーザー設定値において、対物レンズから出射されるレーザーパワーの変化を追跡しました。図３から分かるように、レーザーの設定値が低いほど、ウォームアップの影響が顕著になります。特に低いレーザー設定値でイメージングを行なう際は、60分間のウォームアップを実施した後、顕微鏡性能モニターを使用してレーザーパワーを補正することを推奨します。

_{図２．対物レンズから出射されるレーザーパワーと顕微鏡性能モニターで計測したレーザーパワーとの比較結果}

_{図３．異なるレーザー設定値（1%、10%、25%、50%、75%、100%）での、ウォームアップ中の対物レンズから出射されるレーザーパワー出力の変化}

レーザーパワーを定期的にモニターすることで、レーザーの出力低下、レーザーコンバイナーとファイバーの不具合を発見することができます。

顕微鏡性能モニターを使う上でメンテナンスが必要となるレーザーパワーの基準は、顕微鏡の設置時と比較して、50%以下になった場合としています。この場合、最大出力の50%までしかレーザーを使用できなくなるため、深部観察などのアプリケーションによっては励起光が不十分となる可能性がありますので、修理を依頼することを推奨します。使用頻度は画像を取得するたびに測定し補正することを推奨します。これは、レーザーパワーが温度の変化に敏感であるためです。レーザーを数時間連続使用する場合、システム内部の温度も上昇し、室温に影響を及ぼす可能性があります。このため、画像を取得する度にレーザーパワーを補正することが望ましいと考えます。

検出感度

検出感度の測定系の概要を図４に、図５に検出感度で画像を取得する順番を示したフローチャートを示します。ここでは、各検出器の感度とピンホール位置の二つを測定します。測定のフローは以下の通りです。レーザーパワーと同様に、測定を開始するだけで、システムが自動で以下のフローを実施します。

検出感度

1) 405nmレーザーON、BS10/90をセット、検出器１をONに設定 (選択された検出器にレーザーが入る用に光路が自動調整)

2) 顕微鏡筐体のフィルタターレットに挿入されたコーナーキューブミラーで、レーザー光を減光しつつ正反射

3) レーザー光がBS10/90、ピンホールを通過し、FV4000検出システムへ照射

4) 検出器の感度（画像の中央値）を、インストール時測定した同じ検出器の感度と比較して相対値を計算

5) 検出器１をOFFにし、検出器２をONにして、2)－4)を繰り返し

6) 以降、設置されている全検出器を順番にONにし、2)－4)を繰り返し

ピンホール位置

7) 検出器１を再度ONにし、10箇所（ピンホール面内をXY軸とすると、X軸、 Y軸それぞれで5箇所ずつ計10箇所）のピンホール光軸位置それぞれで、2)－4)を10回繰り返し

_{図４．検出感度測定系の概要}

_{図５．検出感度測定のフローチャート}

検出感度の測定では、各検出器の感度の変動とピンホールの光軸のズレ量を測定します。これは装置全体の検出感度の低下がピンホール光軸位置のズレに起因することがあるためです。X軸方向とY軸方向の両方で、11個のピンホール光軸位置と、それに対応する検出システムの出力値の関係をグラフ化したものを図６の左上と中上のグラフに示します。また、これらのグラフでは、11個のデータ点のうち５個を使って作成されたガウス近似曲線も表示しています。ガウス近似を用いることで、ピンホール光軸の中心位置のデータを取得できていなかった場合でも、そのズレ量を高い精度で算出することが可能です。

ピンホールの光軸ズレによって生じる蛍光強度の低下は、対物レンズの倍率と開口数（NA）によって異なります。ピンホールは対物レンズの焦点面と共役な位置に配置されており、ピンホール面でのエアリーサイズは対物レンズの倍率、投影レンズの倍率、および焦点面でのエアリーサイズの３つの要素で決まります。図６の右上のグラフでは、ピンホール光軸のズレ量と２種類の対物レンズを使用した際の細胞標本内の蛍光強度の関係が示されています。図６の下部には３枚の蛍光画像の例を示しており、これらはUPLXAPO20Xを用いて、ピンホールの光軸がそれぞれ-0.5AU, 0AU(基準), +0.5AUずれた状態で撮影された細胞画像です。図6の右上のグラフは、これらの画像と同様、それぞれのズレ量で取得された画像から得られた蛍光強度を基にプロットされています。ここで使用されたのは、UPLXAPO20X (NA 0.8)とUPLSAPO100XS（NA 1.35）の２つの対物レンズです。投影レンズの倍率が1倍の場合の結果が示されており、ピンホール光軸が0.32 AU（UPLXAPO20Xでのエアリーサイズを1とした場合）ずれると、UPLXAPO20Xでは蛍光強度が10%低下し、UPLSAPO100XSでは1.1%低下することがわかります。このように、対物レンズによってピンホール光軸のズレの影響が異なります。

_{図６．（左上,中上）ピンホール光軸ズレ vs 検出感度測定値。（右上）ピンホール光軸ズレ vs UPLXAPO20X, UPSAPO100XSの蛍光強度。（下部）それぞれUPLXAPO20Xを用いて、ピンホール光軸がそれぞれ-0.5AU, 0AU, +0.5AUずれた状態で取得された細胞画像。}

検出感度のメンテナンスが必要になる基準の値は、装置の設置時と比較して検出感度が80%未満に低下した場合です。また、ピンホールの光軸中心のズレ量の判定基準は、最も影響が大きいとされるUPLXAPO20を使用した場合の蛍光強度の低下率から設定しました。ユーザー自身での修正・修理は困難なため、もし結果で「Failed」が続く場合は、修理を依頼することをお勧めします。

検出感度の測定頻度については、共焦点レーザー走査型顕微鏡システムを起動する度に実施することを推奨します。また、気温の変化やシステムのウォームアップ時間によっても検出感度は微妙に変わる可能性があるため、数日間に渡って観察を続ける場合は、24時間ごとの測定を推奨します。

結像性能

図７では、エッジチャート標本の三次元反射観察を用いて、三次元の線拡がり関数（LSF: Line spread function）を算出する方法について説明しています。このプロセスでは、反射像の測定から結像性能を定量的に評価するまで以下の手順の通りです。

1) 測定する対物レンズを選択

2) エッジチャート標本をステージに設置

3) 561nmのレーザーをONにし、BS10/90をセットし、使用する検出器１つをONに設定

4) ピンホールは２AUに設定し、エッジチャート標本の三次元の共焦点反射像を取得

5) 三次元像から、八方向からなる三次元のエッジ応答を抽出

6) エッジ応答を微分してLSFを算出

7) 算出した三次元のLSF（3D LSF）と、理想的な結像性能を有するLSFの二次元相互相関値を算出。相関値は、Zero-means Normalized Cross-Correlation（ZNCC）⁷ を使用。

_{図７．3D LSFの抽出方法の概略図．８箇所でXZ方向のLSFを抽出}

対物レンズの設定、ピント合わせ、およびエッジパターンの中心位置合わせといった作業を手動で行なう必要がありますが、これらの作業以外はシステムによって自動的に実行されます。3D LSFを高い精度で測定するために、３つの独自のアプローチを採用しています。まず、ピンホールを意図的に2AUに設定することで、デフォーカス時にも反射光の強度を多く検出できるようにしています。次に、一般的なスターチャートと比較して、明暗の縞模様ペアが８個と少ない標本を使用することで、デフォーカス時に隣接するペアからの反射光との干渉を防ぎます。３つ目は、エッジパターンの厚さを極薄にすることで、理論値に近いエッジ応答を得ることが可能になっています。これらのアプローチにより、より正確で信頼性の高い3D LSFの測定を実現しています。通常、結像性能の評価には点広がり関数（PSF: Point spread function）が一般的に使用されます。PSFは、単一の点がどのように画像上に現れるかを示し、異方性のある結像性能の劣化を捉えることができます。しかし、LSFは線がどのように画像化されるかを示し、特定の方向の結像性能の低下を見逃す可能性があります。本手法では、3D LSFを8方向で取得することで、3次元のPSF（3D PSF）とほぼ同等の情報が得られます。図８では、コマ収差が発生したときの3D PSFと、8方向の2次元LSF（2D LSF）のシミュレーション結果を示しています。コマ収差は、対物レンズ内のレンズが傾いた時、標本のカバーグラスやステージが対物レンズに対し傾いた時に発生します。3D PSFは、バナナ型の形状をしており、2D LSFも同様にバナナ型の形状が見られます。ただし、特定の方向では、コマ収差のような異方性のある収差は2D LSFでは捉えらず、無収差のように見えることがあります。このため、８方向で2D LSFを取得することにより、3D PSFと同様に異方性を持つ情報を捉えることが可能です。

_{図８．シミュレーションで得られた3D PSFと3D LSFの比較}

8方向のLSFがPSFと同等レベルであることを定量的に検証するため、コマ収差および球面収差の収差量を変えながら、PSFのストレール比とLSFのZNCCを計算しました。ストレール比とは、光の集光度を定量的に示す値であり、無収差光学系で得られる理想的なPSFにおける中心強度を100%とした場合の、実際の光学系のPSFにおける中心強度の比率で表されます。ストレール比は、対物レンズの品質管理の指標である波面収差との相関が高いことでも知られています。コマ収差は先ほど記述したように、顕微鏡使用時に発生する収差の一つであり、球面収差も対物レンズの補正環の調整不足やイマージョン液の間違い、表面に誤って付着した液体などによって発生する収差です。グラフには、これらの収差の影響を示しています。ZNCCの値は、８方向での計算結果を平均化したものです。また、参考として、PSFのFWHM（Full Width at Half Maximum）とストレール比の比較グラフも示しています。ストレール比とFWHMは、PSFを定量的な指標の一つです。

図9のグラフからは、PSFのストレール比とLSFのZNCCとの間に高い相関があり、線形回帰の決定係数R^2が0.959と高いことが分かります。これは、3D LSFのZNCCが3D PSFのストレール比と置き換え可能であることを示唆しています。一方で、FWHMとストレール比の間には相関がありながらも、一様な閾値設定には注意が必要であることが示唆されています。例えば、測定したFWHMが340nmであった場合、理論値の320nmと近いため結像性能に問題ないと判断することもありますが、実際は球面収差によってストレール比が65%まで低下しているケースがあり得ます。3D LSFから算出したZNCCを使用することで、PSFのFWHMよりも高い精度で結像性能を判定することできます。また、もう一つの指標であるストレール比を直接測定するには、顕微鏡とは別に波面収差を測定する装置が必要なためユーザーが直接行なうことは困難です。 そのため、ユーザーが結像性能の判定する際にはZNCCを用いることが適切だと考えられます。

_{図９． 3D-PSFから算出したストレール比と、3D LSFから算出したZNCC（上図）および3D PSFから算出したFWHM（下図）の関係性}

結像性能のメンテナンスが必要となる基準は、ストレール比換算で80%未満となった場合です。一般にストレール比の80%が回折限界と呼ばれ、80%未満では対物レンズとして満足できる性能を有しているとは言えません。

結像性能の測定頻度については、共焦点レーザー走査型顕微鏡システムを起動する度に実施することをお勧めします。また、使用者が変わる場合、前の使用者が対物レンズの使い方を誤った可能性があるため、24時間以内であっても測定することを推奨します。
 

顕微鏡性能モニターの応用例

本ソリューションの応用例として、蛍光定量のための対照実験でのコントロールサンプルの定量評価の結果を図10に示しています。本来「コントロールサンプル」とは行う実験によって異なりますため、本例においては、蛍光強度の基準をそろえるためのサンプルをコントロールサンプルと定義しました。

この例では、１回目の実験を行なった後、２回目の再実験を１か月後に行いました。 １回目には蛍光観察のための条件を設定した後に実験を行ない、２回目は装置を起動してすぐに実験を行ないました。本来レーザーを含む共焦点レーザー走査型顕微鏡では、メーカーの仕様に従ってウォームアップをしなければいけませんが、分かりやすく効果を示すため、起動後すぐに実験を行ないました。図10のグラフでは、1回目と2回目のコントロールサンプルの蛍光強度を、顕微鏡性能モニターを使用した場合と使用していない場合で比較しています。結果から、顕微鏡性能モニターで性能を補正しなかった場合、装置起動直後の性能が不安定でデータの揺らぎが大きくなることが分かります。一方で、性能を補正した場合は、日をまたいだ実験でも精度高く蛍光定量が可能なことを示唆しています。

_{図10．２日間の実験におけるコントロールサンプルの蛍光強度の変動}
 

まとめ

顕微鏡性能モニターは、共焦点レーザー走査型顕微鏡のような複雑なシステムの管理者に対して半自動的なメンテナンス機能を提供します。 これにより、保守メンテナンスの作業効率が向上し、他の管理者へのメンテナンストレーニングが不要になります。結果として、主管理者の業務効率が改善されます。さらに、装置トラブルが発生していた場合のトラブル要因分析やメーカーへの説明といった業務から解放され、装置ダウンタイムの発生も未然に防ぐことが可能です。それだけでなく、顕微鏡性能モニターで性能計測・管理が簡単になることで、ユーザーに対し、装置のウォームアップや対物レンズの補正環調整の重要性、対物から出射されるレーザーパワーの変動に関する啓蒙にも繋がります。

実験で装置を使用するユーザーにとっては、実験前に蛍光強度の変動に関わる性能をモニターすることで、蛍光定量の変動を低減できることが示されています。これにより、画像や定量データのばらつきを抑えることができます。また、システムが半自動で測定するため、顕微鏡初心者でも簡単に測定でき、実験結果が意図したものでなかった場合、装置かサンプルのどちらが原因かを判別するのに役立ちます。今後は、個々のユーザーの実験の再現性だけでなく、さらに論文の再現性も向上させることが重要と考えています。このために、エビデントは顕微鏡性能の測定データのトレーサビリティを向上させるための取り組みを続けていききます。

※本内容は、理研CBS-エビデント連携センター（BOCC）の技術開発を基にしており、特許出願済みです。
 

著者

米丸　泰央
Advanced Technology, R&D, Evident Corporation

1. G. Nelson, et al. “QUAREP-LiMi: A community-driven initiative to establish guidelines for quality assessment and reproducibility for instruments and images in light microscopy”, Journal of Microscopy, vol. 284 (1), 56–73, (2021).
2. U. Boehm, et al. “QUAREP-LiMi: A Community Endeavor to Advance Quality Assessment and Reproducibility in Light Microscopy.” Nature Methods, vol. 18, 1423–1426. (2021).
3. H. K. Jambor. “A Community-Driven Approach to Enhancing the Quality and Interpretability of Microscopy Images.” Journal of Cell Science vol. 136 (24), jcs261837, (2023).
5. ISO 21073-2019 “Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging”
6. O. Faklaris, et al. “Quality Assessment in Light Microscopy for Routine Use through Simple Tools and Robust Metrics.” Journal of Cell Biology, vol 221 (11), e202107093, (2022).
7. Lewis, J. P. "Fast Normalized Cross-Correlation." Industrial Light & Magic, 1995.