共焦点顕微鏡の走査システム

共焦点イメージングでは、空間的にフィルタリングされた試料の個々のポイントからの連続した光を収集した後、電子信号処理を経て、最終的には対応する画像ポイントとして画像表示されます。ポイントごとの信号収集プロセスには、対物レンズの下で試料の厚みを通って集束する照明ビームを走査するメカニズムが必要です。一般に、共焦点顕微鏡画像の生成には主に3種類の走査法が使用されています。基本的に同等の共焦点作用を得るには、固定の照明ビームと共役の横方向に移動する試料ステージを使用する（ステージ走査）、固定ステージとともに走査光ビームを使用する（ビーム走査）、またはステージと光源を固定したまま、回転するニポウディスク（走査ディスクともいう）の開口部を通った点光線で試料を走査する方法があります（図1と2を参照）。どの方法も特定の共焦点アプリケーションには好都合ですが、その他には有用性が限られる性能特性があります。

ステージ走査とビーム走査の構成はシングルビーム方式であるのに対して、走査ディスク法はマルチビーム走査方式です。ニポウディスク走査の概念を取り入れたシステムでは、照明にレーザーではなくノンコヒーレントな広域スペクトル光源（アーク放電ランプなど）を使用するのが一般的で、全体的な明るさの不足によって蛍光アプリケーションでの使用が大幅に制限されます。ただし、最新のマイクロレンズアレイと精緻なディスク設計の改良に、レーザー照明も加わって、スピニングディスク型共焦点顕微鏡の応用の可能性は広がっています。ニポウディスクシステムの設計には、タンデム走査と単一走査があります。前者では、照明と検出ビームがタンデム光路をたどり、ディスクの対極にある同一の開口部を通ります。単一走査システムでは、ディスク上の回転する開口部から照明と検出が同時に行われ、2本の光路が対物レンズを同時に通るように維持されます。

単一ビーム走査のもう1つの方法として、特殊な落射型顕微鏡で限定的に用いられる、主に集積回路検査を目的としたものがあります。対物レンズ自体を通して走査レンズシステム内の固定された光源を使用し、固定された試料全体を走査します。この構成は光学的にステージ走査と似た利点がありますが、固定された試料を測定プローブに取り付ける、あるいは操作することができます。比較的大きな従来の対物レンズを使用する場合、この構成では高速走査に適さないため、一般的には使用されていません。

最新の共焦点顕微鏡のほとんどは、広視野落射蛍光装置をベースにした統合電子システムであり、複数のレーザー光源、電子・光学部品が組み込まれた走査ヘッド、画像表示用のコンピューターとモニター、信号取得、処理、画像解析を制御するための関連ソフトウェアを備えています。基本的な共焦点光学構成において、対物レンズは光源と検出器の両ピンホールの像を試料面に形成します。焦点面と共役にある顕微鏡光軸上にピンホールを配置すると、像は試料焦点面内に重なります。焦点面外の蛍光色素は励起されますが、検出器のピンホールによって、検出は焦点面付近で生じた発光に限定され、焦点外の光は取り除かれます。シングルビーム共焦点レーザー走査型顕微鏡は、この点走査モードでサンプリング装置として機能し、光学（実）像は形成しません。像を形成するには、サンプリングスポットを試料によって動かし、得られる信号を収集して保存します。走査ヘッドは、共焦点画像の作成に必要な光子信号の生成を制御します。標準的な走査ヘッドの構造を図1に示します。一般に組み込まれているものは、1つ以上のレーザー入射光、蛍光フィルターセット、ラスター走査機構、可変型ピンホール開口部、複数の蛍光波長検出用の検出器（通常は光電子増倍管（PMT））です。

共焦点ポイントサンプリングの原理を拡張して、拡大した試料像面を生成するには、テレビ画面（およびその他のビデオアプリケーション。図2（a）を参照）の画像を作るのと同様に、試料の焦点をラスターパターンで走査する必要があります。このメカニズムには、高速の横方向走査（ライン走査）とともに、低速の縦方向走査（フレーム走査）が必要です。これによって、フレームの上から下まで連続した位置に走査ラインが補正されます。共焦点顕微鏡の開発の歴史の中で、点走査を実装するためにさまざまな技法が使用されてきました。そのうちのいくつかは、現在市販されているものに改良されています。シングルビームのレーザー走査装置の場合、標準的なラスター走査機構では、ガルバノメーターモーターで駆動し、相互に直交軸で回転する2枚の高速振動鏡を使用します。X軸とY軸に沿って走査する2枚のミラーが連動して、直線的なラスター走査となります。ミラーの走査速度は光の速度に比べて非常に遅いため、発光された蛍光は対物レンズで集光され、元の光路をたどって共役の検出器ピンホールにある焦点面まで戻る（つまりデスキャンする）ことができます。検出器の開口部に入射する信号強度の変動は、励起ビームが走査されるときの試料内の各点における発光の変動に対応します。

最適なイメージング性能を得るために必要となる、理想的な共焦点走査システムのいくつかの特徴は、実際に達成するのは極めて困難です。ほぼすべての走査システム構成に操作上の弱点があり、その補正のためにさまざまな光学・電子設計の変更が行われています。点走査法のうちのいくつかは、感度の低下、柔軟性や画質の大幅な悪化が見られ、現在市販のシステムでは使用されていません。走査システム設計の最も重要な要件の1つは、走査端部で照明が低下しないように、走査サイクル全体で対物レンズの瞳（後焦点開口部）を完全に光で満たすことです。これを実現する一番の方法として、対物レンズの後側開口部と共役の関係にある固定位置でビームが旋回する操作設計によって、開口部でのビームの動きを最小限にします。走査中にビームが振動するときに固定の旋回点を維持するのは技術的に困難で、システムの中には、ビーム拡大度を増すことによって開口部を満たし、ビーム振動を少し補正するものもあります。これには、光が無駄になりシステムの量子効率が低下するデメリットがあります。

共焦点走査機構にとって望ましいさらなる特性は、イメージング用途に合わせて各種の走査モードを調整する柔軟性を提供するため、できるだけ高いフレームレートで走査することです。このためには、ビーム走査を生み出す可動部品の慣性を最小限にするとともに、ビームが試料を走査していないシステム不感時間（各走査サイクルの間隔）を最短にする必要があります。実際に試料を走査する際の各フルフレーム走査間隔の比率を、システムのデューティサイクルといいます。ビームの非生産的走査を最小限にすることは、高フレームレートの実現に欠かせないだけでなく、一部の装置設計においては、貧弱なデューティサイクル仕様による不要な試料光子損傷の低減にもなります。

光軸の周りの走査ラスターを自由に回転する能力は、共焦点イメージングで試料の形状やその他の特徴に関して走査方向を最適化する手段として、非常に重要です。ファイバー束などの細長い形状のイメージングでは、長軸に平行な高速走査の方向によって、試料信号の時間分解能が大幅に高くなります。さらに、ラスターを回転する能力があると、像面を最も効率的に使用できるように試料形状を方向づけることができます。ラスター方向を回転できない走査の場合、システムの実用性が大きく制限されます。試料自体を簡単に回転できれば別ですが、通常では実現不可能なはるかに難しい操作です。

試料への照明スポットに線形の動きを生み出すために必要な光学配置は、対物レンズがテレセントリック補正されていること（テレセントリックレンズシステムが入射瞳と射出瞳を無限遠点に配置）などの顕微鏡の幾何光学を考慮したものです。対物レンズの完全な光学補正を実現するには、像面と試料面が対物レンズから固定の距離を維持する必要があり、共役の像面と共役のテレセントリック面の位置が既知でなければなりません。重要な光学特性として、すべての光線は、試料面内のソース点位置に応じた角度でテレセントリック面と交わる、というものがあります。平面鏡は光線の伝搬角度を変えることができるため、光軸上の共役のテレセントリック面にミラーを置くと、ビーム角度の変化によって試料内の焦点に線形の動きが生まれます。したがって最も単純なケースでは、対物レンズと共役にあるテレセントリック面の中心を旋回点としてミラーを配置すると、ミラーの旋回角度に応じて試料面内の照明スポット位置を変更可能な、1次元ビームスキャナーとなります。あらゆる共役なテレセントリック面は、対物レンズのテレセントリック面の像です。中間光学系を使用する場合、テレセントリック特性を保ちながら、対物レンズの入射口にミラーの像を作ります。

原理上は、この走査概念を2本の直交軸に広げるには、ミラーを2方向で同時に走査するか、2枚目のミラーを追加することになりますが、通常は実際の考慮事項によって、特定のシステム設計全体について使用する方法の種類が決まります。2枚のミラーを使用して垂直方向にビーム走査する場合、共役のテレセントリック面に置くか、互いに近接して配置します（密結合）。ビームを直交方向にそらすことで、完全な2次元画像の作成に必要なX軸とY軸に沿った高速・低速の走査が可能になります。

基本的な要件が満たされていれば、走査システムコンポーネントはさまざまな配置が可能です。光学系の回折性能を制限するには、走査時に対物レンズの後焦点面（入射開口部）を平面波で常に均一に満たす必要があります。この開口部の物理的な直径は対物レンズの特性によって変わるため、照明ピンホールなどその他すべてのコンポーネントは、使用する対物レンズに合わせます。共役のテレセントリック面は、補助レンズを追加することで必要な位置に作ることができます。この場合、補助レンズの特性について、システムに使用する対物レンズとの互換性があることを十分見極めることも必要です。照明レーザーのビーム特性、特にガウシアンビームの直径は、ピンホール径や、対物レンズの入射開口部の照明に関するその他の変数の調整において、極めて重要な要素です。

最も単純なビーム走査を行う共焦点構成の場合、走査ミラーは走査レンズの後焦点面に置かれます。これは対物レンズの後焦点面と共役の位置になります。図3（a）はシングルミラー配置で、無限遠補正対物レンズに必要な結像レンズも含まれています。この構成では、1軸上の走査が容易に実行されます。理論的に理想的なX-Y走査方法は、両軸上でシングルミラーを同時に走査するというものです（カルダン式走査と呼ばれます）。2枚の走査ミラーはそれより一般的に用いられます。考えられる2つの構成例を図3（b）と3（c）に示しています。ミラーが密結合している場合（図3（b））、中間レンズを追加しなくても十分機能します。走査ミラー間の分離距離がより広い場合（図3（c））、光学性能を最適化するためにマルチレンズによるテレセントリックリレーシステムを使用する必要があります。

X-Yラスター走査の実行メカニズムは共焦点走査システムで最も重要な側面ですが、3次元イメージング用に一連の光学切片を取得したり、X-ZまたはY-Z 2次元画像を取得したり、何らかの形式でフリーラインのZ走査を行ったりするには、何らかの方法でZ軸走査を行う必要があります。標準的な顕微鏡構成では、対物レンズまたは顕微鏡ステージが移動することで、対物レンズと試料の距離が変わります。この移動は、限られた距離範囲ですが、圧電ドライバーまたはガルバノメーター装置を使用して精密に実行できます。ただし、より一般的なのは、顕微鏡のピントの微調整にマイクロステッピングモーターを用いる方式であり、最新の装置では10 nmオーダーの最小ステップサイズで焦点位置を合わせることができます。成体発光アプリケーションの場合、この精度のZ位置合わせで十分対応できます。

シングルビーム装置の技術的発展によって、生細胞の動態プロセスを追うためにビデオレートのイメージングが可能な高速走査装置が開発されています。回転ポリゴンミラースキャナーは走査速度が非常に速く、多くの光学装置で使用されていますが、高解像度顕微鏡への導入に必要な照明と検出精度は得られません。走査ミラーを音響光学偏向器（AOD）と組み合わせた各種構成も研究されています。一部の構成では、AODが一方の軸で非常に高速な走査を行い、ミラースキャナーが低速の軸を制御します。この方法が可能なアプリケーションもありますが、共焦点蛍光イメージングでは問題があります。長い波長の蛍光発光は、波長が固有の音響光学偏光器にデスキャンされないためです。部分的にデスキャンされた信号は、一方の軸上で振動を続け、スリット開口部を通って光電子増倍管に到達するか、リニアアレイCCD検出器上でイメージングされます。得られる画像は1軸上のみに共焦点ですが、この特性は一部のアプリケーションに受け入れられています。シングルビームシステムで高フレームレートを達成する、より一般的な方法は、高速に振動するレゾナントミラースキャナーを使用する方法です。ほとんどの主要メーカーは、標準走査オプションとしてレゾナントスキャナーを組み込み、1秒あたり30フレームのビデオレート画像を完全な視野で得られるようにしています。Yを縮小することで、レゾナントスキャナーは1秒あたり数百フレームの速度を出せます。これは毛細血管血流やカルシウム動態など、一時的に高い解像度が必要なアプリケーションに適しています。

マルチビーム走査法は、その低い照明効率から、以前は高解像度蛍光アプリケーションでの使用に限界がありましたが、シングルビーム走査構成の代替手段となっています。タンデム走査と単一走査のどちらも、回転ディスクスキャナーには数百もの穴が開けられ、顕微鏡の中間像面で照明と検出のピンホールとして機能します。標準的なニポウディスク走査システムの構成を図2（b）に示します。ディスクの穴は、ディスクが回転するとたくさんのビームが均一に像面を走査するように配置されており、シングルビームスキャナーよりはるかに高速に試料を完全にカバーします。ディスク走査型顕微鏡は実像を形成するため、CCDまたはCMOSカメラを像面に直接配置でき、発せられた信号を光電子増倍管よりはるかに高い量子効率で収集します。このように、ディスク走査型共焦点システムには、リアルタイムフォーカスや動態プロセスのイメージングが可能になる利点があるにもかかわらず、いくつかの欠点から実用が限定されてきました。以前は、最も大きな欠点の1つは、主に従来型の広域スペクトル光源に頼っていたことで、ディスクで大量の光の損失が生じていました。しかし、ディスクシステム設計の進歩とレーザー光源の適用によって、効率の問題の一部は克服されています。各ディスクには固定サイズの穴があるため、使用されている特定の対物レンズにピンホール径が一致しない場合があり、特定のディスクとともに最適に機能する対物レンズの選択肢は制限されます。さらに、光源側と検出器側のピンホール径を個別に最適化することはできません。

初期のニポウディスクシステムに見られた明るさの欠如を改善する1つの方法は、マイクロレンズを使用して光源の強度を上げる方法です。旧システムではディスクへの入射光の約1%しか通過せず、低信号レベルを補正するために冷却CCDまたはCMOSカメラを使用する必要がありました。最新のディスク走査型顕微鏡の設計には、数千個ものマイクロレンズが埋め込まれた2枚目のディスクが取り入れられています。このディスクはニポウディスクに合わせて回転し、ニポウディスクの開口部を通る両方向の光を増幅します。マイクロレンズ、レーザー、カメラ技術の進歩に伴い、ディスク走査型顕微鏡は生細胞イメージングアプリケーションに欠かせないツールになっています。

まとめ

共焦点装置が持つ実用的性能の一部を改善する取り組みの中で、スキャナーのさまざまな改良が提案され、実装されています。共焦点蛍光顕微鏡のあらゆる側面は、基本的に効率に関連しており、連続するデータ収集における固有の限界があります。有用な信号を取得するための効率は、画像コントラストと試料に対する光損傷の間で取るべきバランスを定義し、サンプリング走査の空間分解能、SN比、画像取得速度の間で、連続データ収集に必要な調整を制御します。

高解像度蛍光イメージングに関して、現在利用されている最も高度で多用途性のある走査法は、ガルバノメータースキャナーを使用するタイプで、ほとんどの主要顕微鏡メーカーは、この方法を取り入れた共焦点装置を少なくとも1種類は製造しています。量子効率の重要性から、多くの蛍光アプリケーションでは、ディスクスキャナーより比較的シンプルなシングルビーム法が明らかに優位になります。この方法は、さまざまな従来型顕微鏡の光学系やビデオ機器と互換性があり、一般的な顕微鏡原理にうまく適合するほか、ピンホール径調整の柔軟性により、特定の光学系や試料の変動に合わせて最適化できます。