Une imagerie de fluorescence confocale quantitative et fiable grâce au moniteur des performances de microscope

Introduction

Jusqu’à présent principalement utilisée pour réaliser des observations qualitatives, l’imagerie de fluorescence par microscopie optique est de plus en plus employée pour les analyses quantitatives. Pour une telle utilisation, il est recommandé de réaliser régulièrement la maintenance du microscope, la puissance de la source de lumière étant susceptible d’osciller du fait, par exemple, de la fluctuation de la température ambiante, ce qui peut dégrader la qualité d’image. En outre, la puissance du laser du système peut également être altérée à cause de légers écarts d’alignement des composants optiques de la source de laser par rapport à la potence du microscope provoqués par la dilatation thermique du système.

Les microscopes confocaux sont des équipements complexes. Aussi, la maintenance ou l’évaluation de leurs performances sollicitent toutes les compétences d’un technicien qualifié. L’importance du rôle d’une maintenance régulière des microscopes pour garantir la reproductibilité des expériences et la qualité de la recherche a toujours été l’objet de discussions. ^1,2,3,4 L’Organisation internationale de normalisation (ISO) s’est même penchée sur la question dans la norme ISO 21073 2019, qui définit les performances d’imagerie des microscopes confocaux à balayage laser.⁵

Chez Evident, nous comprenons l’importance de cette question et nous nous efforçons d’y apporter des réponses. Lorsque nous avons commercialisé le microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW™ FV4000 en 2023, nous avons décidé de proposer un moniteur des performances de microscope qui aiderait les responsables de services de microscopie et leurs utilisateurs à surveiller trois paramètres de performance clés pouvant avoir un impact sur l’imagerie de fluorescence confocale quantitative et la qualité d’image.

Dans cet article technique, nous parlerons de ces paramètres de performance clés et de la manière dont le moniteur des performances de microscope peut vous aider à obtenir une imagerie quantitative de meilleure qualité. Nous discuterons également des principes et des critères de mesure de chaque performance, ainsi que des avantages apportés par le moniteur des performances aux services de microscopie et à tous les chercheurs désireux d’améliorer au maximum leur imagerie de fluorescence quantitative.
 

Les facteurs de performance en imagerie de fluorescence quantitative à surveiller

En 2022, O. Faklaris et al. ont formulé des recommandations relatives à sept indicateurs de performance de microscope qui doivent être évalués régulièrement et à leur mesure.⁶ Ces sept indicateurs de performance de microscope sont : la stabilité de l’éclairement énergétique, l’efficacité de l’imagerie, la planéité de l’éclairage du champ, les aberrations chromatiques, le décalage de la platine, la répétabilité de la position de la platine et le bruit de fond du détecteur.

La difficulté à mesurer ces performances sans posséder un niveau de compétences en microscopie optique très élevé constitue toutefois un véritable défi. Étant donné qu’une telle expertise s’avère difficile à acquérir, la maintenance régulière des microscopes visant à s’assurer que ces sept facteurs restent dans les limites cibles se révèle compliquée à mettre en œuvre, notamment pour les responsables de service de microscopie ayant la charge de plusieurs systèmes de microscope.

Evident a, dans un premier temps, mis au point une solution qui permet aux utilisateurs de mesurer facilement les signaux de fluorescence. Les variations des signaux de fluorescence sont difficiles à déterminer à partir d’une image. Aussi, contrairement aux aberrations chromatiques lors des analyses de colocalisation ou aux décalages de platine en imagerie à intervalles qui sont plus faciles à observer, il est fort probable que les chercheurs n’arrivent pas à identifier ces variations. L’un des objectifs du moniteur des performances de microscope est de permettre aux chercheurs de remarquer les écarts de performance très tôt durant le processus, plutôt qu’une fois l’expérience d’imagerie achevée, ce qui peut fausser les résultats et amener à recommencer l’expérience.

La luminosité d’un microscope à fluorescence est fortement dépendante de trois des sept indicateurs mentionnés ci-dessus, à savoir la stabilité l’éclairement énergétique, l’efficacité de l’imagerie et la sensibilité de détection.
Cela est dû au fait que la luminosité de la fluorescence dépend de l’intensité de la lumière irradiée sur l’échantillon et de l’efficacité avec laquelle les signaux de fluorescence peuvent être détectés.

Avec un microscope à fluorescence, l’intensité de la lumière irradiée sur l’échantillon dépend de la puissance du laser et de la surface irradiée. La surface irradiée est déterminée par l’efficacité de l’imagerie, qui est une mesure de l’exactitude avec laquelle un instrument optique peut focaliser en un point le flux lumineux émis par une source de lumière. En d’autres termes, la focalisation du faisceau laser et l’intensité de la lumière irradiée sur l’échantillon varient avec l’efficacité de l’imagerie.

Ensuite, l’efficacité avec laquelle les signaux fluorescents peuvent être détectés dépend de la sensibilité de détection du système tout entier. Par conséquent, il est important de surveiller les variations de la puissance du laser, de l’efficacité de l’imagerie et de la sensibilité de détection si l’on souhaite obtenir une imagerie de fluorescence quantitative constante et de haute qualité.

Il est primordial de surveiller la puissance du laser, car la puissance du laser irradié à travers l’objectif peut varier en raison des fluctuations de la température ambiante ou d’autres facteurs. Le moniteur des performances de microscope mesure la puissance du laser juste après que celui-ci a pénétré dans le système FV4000 depuis la sortie de la fibre, ce qui permet au système de déterminer si la puissance a changé depuis l’installation du microscope. En ajustant automatiquement la puissance de sortie du laser, le système est à même de corriger les fluctuations, ce qui lui permet d’assurer une valeur constante au fil du temps.

La sensibilité de détection doit être surveillée pour comprendre d’un point de vue quantitatif toute baisse de l’efficacité de la détection des composants optiques ou tout écart d’alignement de l’axe optique du sténopé depuis l’installation du microscope. Il est essentiel de conserver la position centrale du sténopé pour les microscopes confocaux à balayage laser. Cependant, celle-ci peut se décaler si la température ambiante fluctue de manière significative en raison, par exemple, des changements de saison. Si le microscope est installé dans un environnement dans lequel la température est strictement contrôlée et reste constante, il n’est pas nécessaire de surveiller la sensibilité de détection. Toutefois, tous les microscopes confocaux à balayage laser ne sont pas installés dans des environnements aussi stables. En outre, bien que rares, la poussière et les rayures présentes sur la surface de la lentille de l’objectif peuvent également réduire la transmission de la lumière. Cependant, étant donné que ce changement est graduel, il peut être difficile de remarquer la lente baisse des performances.

Les variations de l’efficacité de l’imagerie sont principalement dues à des rayures sur la surface de l’objectif, à des poussières, à l’utilisation de la mauvaise huile d’immersion ou au mauvais réglage de la bague de correction. En l’absence de solides connaissances en microscopie, il est difficile de remarquer la plupart de ces problèmes d’efficacité de l’imagerie. Dans certains cas, nous avons constaté que les problèmes de baisse de l’efficacité étaient liés à la chute d’un objectif sans que le responsable du service de microscopie en soit conscient, car la chute n’avait pas été signalée.

Bien que les problèmes de baisse de l’efficacité de l’imagerie ci-dessus soient causés par des altérations au niveau de l’objectif, d’autres facteurs, comme le mauvais alignement des miroirs et des lentilles par rapport à l’axe optique provoqué par des variations de température, peuvent également être à l’origine de ces problèmes d’efficacité.
 

Fonctionnement du moniteur des performances de microscope

Le moniteur des performances de microscope mesure de manière indépendante la puissance du laser, la sensibilité de détection et l’efficacité de l’imagerie. Vous trouverez ci-après des explications sur la manière dont le système mesure chaque indicateur.

Puissance du laser

La figure 1 représente une vue d’ensemble du système de mesure de la puissance du laser du moniteur des performances de microscope. Une fois la mesure démarrée, le système lance automatiquement la séquence suivante.

1) Laser à 405 nm réglé sur 100 %, autres lasers réglés sur 0 %.

2) Émission d’un faisceau laser.

3) Le faisceau laser est partiellement réfléchi par le séparateur de faisceau (BS) situé immédiatement après la fibre d’introduction du faisceau laser dans le microscope FV4000.

4) Le faisceau laser d’entrée atteint un photodétecteur (le moniteur de puissance du laser, LPM) installé dans le microscope FV4000.

5) Le système calcule la puissance de sortie du laser à 100 % de la valeur réelle de sortie du LPM.

6) Réglez le laser sur 0 %, puis réglez le laser à longueur d’onde courte sur 100 %.
Répétez dans l’ordre les étapes 2 à 6 pour tous les lasers installés.

_{Figure 1 – Schéma du système de mesure de la puissance du laser}

La correction automatique de la puissance du laser est effectuée à partir de la valeur mesurée par le LPM. La valeur de sortie mesurée est comparée à la valeur de sortie au moment de l’installation du microscope. La différence entre les deux valeurs est calculée et exprimée en pourcentage. Les paramètres de contrôle du laser sont ajustés en fonction du pourcentage calculé afin de garder la valeur de sortie de la puissance du laser constante. Nous recommandons aux utilisateurs d’utiliser cette fonction de mesure de la puissance du laser avant chaque acquisition d’images afin de s’assurer que la puissance du laser reste constante d’une expérience d’imagerie à l’autre.

Pour déterminer dans quelle mesure la puissance du laser mesurée par le moniteur des performances de microscope correspond à l’intensité lumineuse effectivement émise sur l’échantillon, nous avons mesuré pendant six mois la puissance du laser avec le moniteur des performances et que la puissance du laser en sortie de l’objectif. Les résultats sont présentés dans la figure 2. La puissance du laser en sortie de l’objectif a été mesurée avec l’objectif UPLSAPO10X.

Comme illustré sur la figure 2, il existe une forte corrélation entre la puissance du laser mesurée par le moniteur des performances du microscope et la puissance du laser en sortie de l’objectif ; l’exactitude des mesures a été confirmée comme étant à 5 % près. Toutefois, lorsque la puissance du laser est réglée sur faible, la puissance du laser en sortie de l’objectif n’est pas stable si l’instrument n’a pas été suffisamment préchauffé. La figure 3 représente les résultats enregistrés sur une période de préchauffage du système de deux heures. Les variations de la puissance du laser en sortie de l’objectif ont été enregistrées pour six valeurs de consigne du laser : 1, 10, 25, 50, 75 et 100 %. Comme vous pouvez le voir sur la figure 3, plus la valeur de réglage du laser est faible, plus le préchauffage a son importance. D’après ces données, nous recommandons aux utilisateurs de préchauffer leur système pendant au moins 60 minutes, puis d’utiliser le moniteur des performances du microscope pour corriger la puissance d’excitation avant de commencer à prendre des images.

_{Figure 2 – Comparaison entre la puissance du laser mesurée en sortie de l’objectif et la puissance du laser mesurée par le moniteur des performances}

_{Figure 3 – Variation de la puissance du laser en sortie de l’objectif pendant le préchauffage à différentes valeurs de réglage du laser (1, 10, 25, 50, 75 et 100 %)}

La surveillance régulière de la puissance du laser permet de détecter une faible puissance au niveau du laser ainsi que les défauts au niveau du combinateur de lasers et de la fibre. La maintenance doit être effectuée dès lors que la puissance de sortie passe sous les 50 % de la valeur de la puissance de sortie mesurée lors de l’installation du microscope. À ce seuil, la puissance du laser peut s’avérer insuffisante pour certaines applications, comme l’observation en profondeur, même si la puissance de sortie effective est toujours corrigée afin de rester constante.

Si les lasers sont utilisés en continu pendant plusieurs heures, la chaleur dégagée par le système peut avoir une incidence sur la température ambiante et entraîner ainsi des fluctuations de la puissance des lasers. Pour cette raison, nous recommandons aux utilisateurs de suivre la durée d’utilisation des lasers et de corriger leur puissance à chaque acquisition d’une image puisque le microscope est sensible aux changements de température.

Sensibilité de détection

Deux caractéristiques sont mesurées pour la sensibilité de détection : la sensibilité de chaque détecteur et la position du sténopé. La figure 4 représente une vue d’ensemble du système de mesure de la sensibilité de chaque détecteur, tandis que la figure 5 représente un organigramme illustrant l’ordre dans lequel les images sont acquises selon la sensibilité de détection. À l’instar de la mesure de la puissance du laser, le système exécute automatiquement la séquence suivante une fois que la mesure commence.

Sensibilité de détection

1) Sélectionnez le séparateur de faisceau BS10/90 et mettez le laser de 405 nm et le détecteur 1 sous tension (le trajet optique est automatiquement ajusté de sorte que le faisceau laser se reflète dans le détecteur sélectionné).

2) Le coin de cube inséré dans la tourelle porte-miroirs de la potence du microscope reflète le faisceau laser tout en réduisant sa puissance.

3) Le faisceau laser passe dans le séparateur de faisceau et le sténopé pour atteindre le système de détection du microscope FV4000

4) Calculez la sensibilité relative du détecteur (valeur médiane de l’image) et comparez-la à la sensibilité du même détecteur mesurée lors de son installation.

5) Mettez le détecteur 1 hors tension, puis mettez le détecteur 2 sous tension. Répétez alors les étapes 2 à 4.

6) Répétez ce processus pour tous les détecteurs installés.

Position du sténopé

7) Sélectionnez à nouveau le détecteur 1, et répétez 10 fois les étapes 2 à 4 pour chacune des 10 positions de l’axe optique du sténopé (5 positions pour chacun des axes X et Y, à l’endroit où la surface du sténopé correspond à l’axe XY).

_{Figure 4 – Schéma du système de mesure de la sensibilité de détection}

_{Figure 5 – Organigramme de la mesure de la sensibilité de détection}

La mesure de la sensibilité de détection consiste à mesurer la variation de la sensibilité de chaque détecteur et le décalage de la position de l’axe optique du sténopé. Une baisse de la sensibilité de détection générale de l’appareil peut s’expliquer par un écart d’alignement des positions de l’axe optique du sténopé.

La figure 6 représente des graphiques illustrant la relation entre les 11 positions de l’axe optique du sténopé et les valeurs de sortie correspondantes du système de détection sur les axes X et Y (graphiques en haut à gauche et en haut au milieu). Ces graphiques représentent également des courbes d’approximation de Gauss tracées à partir de 5 des 11 points de données. Grâce à l’approximation de Gauss, l’amplitude de déplacement peut être calculée avec un niveau élevé d’exactitude, même en l’absence de données pour la position centrale de l’axe optique du sténopé.

La baisse de l’intensité de la fluorescence causée par un écart d’alignement de l’axe optique du sténopé dépend du grossissement et de l’ouverture numérique (ON) de l’objectif. Le sténopé est positionné de manière conjuguée au plan focal de l’objectif et la taille de la tache d’Airy au niveau du plan du sténopé est déterminée par trois facteurs : le grossissement de l’objectif, le grossissement de la lentille de projection et la taille de la tache d’Airy au niveau du plan focal.

Le graphique situé en haut à droite de la figure 6 représente la relation entre le degré d’écart d’alignement de l’axe optique du sténopé et l’intensité de la fluorescence au niveau de l’échantillon cellulaire lorsque deux types d’objectifs sont utilisés. La partie inférieure de la figure 6 illustre trois exemples d’images de fluorescence de cellules prises avec un objectif UPLXAPO20X avec des axes optiques du sténopé décalés de -0,5 AU, 0 AU (normal) et +0,5 AU. Le graphique situé en haut à droite de la figure 6 est tracé à partir des valeurs d’intensité de fluorescence mesurées à partir de ces images ainsi que d’images acquises à chaque amplitude de décalage avec des objectifs UPLXAPO20X (ON 0,8) et UPLSAPO100XS (ON 1,35).

Les résultats sont donnés pour une lentille de projection de grossissement 1X et montrent que lorsque l’axe optique du sténopé est décalé de 0,32 AU (en supposant une taille de tache d’Airy de 1 pour l’objectif UPLXAPO20X), l’intensité de la fluorescence décroît de 10 % pour l’objectif UPLXAPO20X et de 1,1 % pour l’objectif UPLSAPO100XS. Ces résultats indiquent que l’effet de l’écart d’alignement de l’axe optique du sténopé diffère selon l’objectif utilisé.

_{Figure 6 – Sensibilité de détection en fonction de la valeur de la mesure de l’écart d’alignement de l’axe optique du sténopé (en haut à gauche et en haut au milieu). Intensité de la fluorescence avec les objectifs UPLXAPO20X et UPSAPO100XS en fonction de l’écart d’alignement de l’axe optique du sténopé (en haut, à droite). Images de cellules acquises avec un objectif UPLXAPO20X avec, respectivement, un écart d’alignement de l’axe optique du sténopé de -0,5 AU, 0 AU et +0,5 AU (illustrations du bas).}

La maintenance doit être effectuée lorsque la sensibilité de chaque détecteur passe sous le seuil de 80 % de la valeur mesurée lors de l’installation du système. Les critères d’évaluation de la position du sténopé sont basés sur le taux de réduction de l’intensité de la fluorescence lors de l’utilisation de l’objectif UPLXAPO20X, qui s’avère être l’objectif ayant le plus grand impact. Étant donné que les chercheurs rencontrent des difficultés pour ajuster par eux-mêmes la sensibilité du détecteur et la position du sténopé, nous recommandons aux utilisateurs de contacter Evident si les résultats de la mesure de la sensibilité du détecteur sont toujours marqués comme « En échec ».

Du fait que la sensibilité de détection peut fluctuer légèrement en raison des variations de la température ambiante et du préchauffage du système, nous recommandons de mesurer régulièrement la sensibilité de détection et pour expérience d’imagerie quantitative critique.

Efficacité de l’imagerie

La figure 7 représente la méthode de calcul de la fonction d’étalement linéaire tridimensionnel (3D LSF) à l’aide de la méthode d’observation de la réflexion tridimensionnelle d’un graphique de contour. Le processus suit les étapes ci-dessous de la mesure de l’image réfléchie à l’évaluation quantitative de l’efficacité de l’imagerie.

1) Sélectionnez un objectif pour lequel faire les mesures.

2) Placez un graphique de contour sur la platine du microscope FV4000.

3) Mettez sous tension le laser 561 nm, mettez en place le séparateur de faisceau BS10/90 et activez un détecteur.

4) Réglez le sténopé sur 2 AU afin d’acquérir des images de réflexion confocale tridimensionnelle du graphique de contour.

5) Extrayez les réponses à un bord 3D de l’image 3D jusqu’à obtenir huit directions différentes.

6) Calculez la LSF en différenciant la réponse à un bord.

7) Calculez la 3D LSF et les valeurs de corrélation croisée 2D de la LSF avec une efficacité d’imagerie optimale ; les valeurs de corrélation ont été acquises à partir des mesures de la corrélation croisée normalisée (ZNCC).⁷

_{Figure 7 – Schéma de la méthode d’extraction de la 3D LSF. 8 LSF sont extraites dans la direction XZ}

Le moniteur des performances de microscope réalise automatiquement toutes les autres tâches, sauf celles nécessitant une intervention manuelle comme le réglage de l’objectif, la mise au point et le centrage du motif des contours.

Trois approches uniques sont utilisées pour mesurer la 3D LSF avec une grande exactitude. Tout d’abord, nous avons réglé de manière intentionnelle le sténopé sur 2 AU de sorte que l’intensité de la lumière réfléchie puisse être détectée, même pendant la défocalisation. Ensuite, nous avons utilisé un graphique avec seulement huit paires de bandes claires/foncées, donc moins que dans un diagramme en étoile typique, ce qui évite les interférences avec la lumière réfléchie par des paires adjacentes lors de la défocalisation. Enfin, nous avons créé un motif des contours extrêmement fin, ce qui nous a permis d’obtenir des réponses à un bord proches des valeurs théoriques. Ces approches permettent d’obtenir des mesures de la 3D LSF plus précises et plus fiables.

La fonction d’étalement du point (PSF), qui est généralement utilisée pour évaluer l’efficacité de l’imagerie, montre comment un point isolé apparaît sur l’image et permet d’identifier la dégradation anisotrope de l’imagerie. La LSF, quant à elle, montre comment les lignes sont imagées et peut ne pas permettre d’identifier la dégradation de l’efficacité de l’imagerie dans certaines directions.

Dans la méthode exposée ci-dessus, la 3D LSF est acquise dans huit directions, fournissant ainsi des informations presque équivalentes à celles de la PSF en trois dimensions (3D PSF). La figure 8 représente les résultats simulés d’une 3D PSF et d’une 2D LSF dans huit directions en cas d’aberration de coma, cette dernière survenant lorsque l’objectif est incliné et lorsque la lamelle couvre-objet de l’échantillon ou la platine est inclinée par rapport à l’objectif.
Les représentations de la 3D PSF et de la 2D LSF sont, toutes deux, en forme de banane. Toutefois, dans certaines directions, les aberrations anisotropes, comme l’aberration de coma, ne sont pas identifiées par la 2D LSF. Aussi, il se peut que les représentations de la 2D LSF semblent exemptes d’aberrations. L’acquisition d’une 2D LSF dans 8 directions permet de recueillir des informations anisotropes et la 3D LSF.

_{Figure 8 – Comparaison de la 3D PSF et de la 3D LSF obtenue à partir d’une simulation}

Pour vérifier quantitativement que la LSF dans 8 directions se trouve au même niveau que la PSF, nous avons calculé le rapport de Strehl de la PSF et la corrélation croisée normalisée centrée (ZNCC) de la LSF tout en modifiant le degré d’aberrations de coma et sphériques. Le rapport de Strehl est une valeur qui permet de quantifier l’intensité lumineuse du point focal et qui s’exprime comme le rapport de l’intensité du centre de la tache d’Airy de la PSF du système optique réel sur celle de la PSF idéale (100 %) obtenue avec un système optique sans aucune aberration. Il est également connu pour être fortement corrélé aux aberrations du front d’onde, ce qui est un indicateur utile pour le contrôle qualité des objectifs.

Comme nous l’avons déjà décrit précédemment, l’aberration de coma est une des aberrations susceptibles de survenir lors de l’utilisation d’un microscope tandis que l’aberration sphérique peut être causée par un réglage inadapté de la bague de correction de l’objectif, l’utilisation d’un mauvais milieu d’immersion ou l’adhérence d’un liquide à l’objectif ou à la surface de l’échantillon. Le graphique montre les effets de ces aberrations ; les valeurs de la ZNCC sont des moyennes des résultats des calculs effectués pour les 8 directions. Également présenté pour référence, l’un des graphiques représente la largeur à mi-hauteur (LMH) de la PSF en fonction du rapport de Strehl. Le rapport de Strehl et la LMH sont deux indicateurs quantitatifs de la PSF.

Le graphique de la figure 9 indique qu’il existe une forte corrélation entre le rapport de Strehl de la PSF et la ZNCC de la LSF, avec un fort coefficient de détermination R2 de 0,959 dans le modèle de régression linéaire. Cela suggère que la ZNCC de la 3D LSF peut se substituer au rapport de Strehl de la 3D PSF. En outre, même s’il y a une corrélation entre la LMH et le rapport de Strehl, il convient tout de même de faire attention lorsque l’on fixe une valeur seuil basée uniquement sur la LMH. Par exemple, si la valeur de la LMH est de 340 nm, on peut supposer une absence de problème concernant l’efficacité de l’imagerie, car cette valeur est proche de la valeur théorique (320 nm), mais il est possible que le rapport de Strehl soit réduit à 65 % à cause d’une aberration sphérique. La ZNCC calculée à partir de la 3D LSF peut néanmoins être utilisée pour déterminer l’efficacité de la formation de l’image avec une meilleure exactitude que la LMH de la PSF.

La mesure directe du rapport de Strehl requiert l’utilisation d’un dispositif de mesure de l’aberration du front d’onde indépendant du microscope, ce qui rend difficile la mesure directe de cet autre indice par l’utilisateur. Aussi, les utilisateurs peuvent utiliser la ZNCC pour déterminer l’efficacité de l’imagerie.

_{Figure 9 – Relation entre le rapport de Strehl calculé à partir de la 3D PSF et la ZNCC calculée à partir de la 3D LSF (en haut) et la LMH calculée à partir de la 3D PSF (en bas)}

La maintenance pour corriger une baisse de l’efficacité de l’imagerie doit être effectuée dès lors que la valeur du rapport de Strehl chute sous le seuil de 80 %. Cette valeur seuil du rapport de Strehl (80 %) est généralement appelée limite de diffraction, et un objectif dont la valeur du rapport de Strehl est inférieure à 80 % possède des performances insatisfaisantes. Nous recommandons aux utilisateurs d’exécuter une évaluation de l’efficacité de l’imagerie à chaque fois qu’ils démarrent leur système FV4000. Nous leur recommandons de refaire cette évaluation à chaque changement d’utilisateur et après 24 heures d’utilisation.
 

Applications du moniteur des performances de microscope

La figure 10 représente les résultats d’une évaluation quantitative d’un échantillon de contrôle lors d’une expérience de quantification de la fluorescence. L’échantillon de contrôle change d’une expérience à l’autre. Cependant, dans cet exemple, l’échantillon utilisé est celui pour étalonner l’intensité de la fluorescence. La seconde expérience de cet exemple a été réalisée un mois après la première. La première expérience a été réalisée une fois que les conditions pour l’observation de la fluorescence ont été établies, tandis que la deuxième expérience a été réalisée immédiatement après la mise sous tension du microscope.

Bien que les microscopes confocaux équipés de lasers doivent préchauffer, conformément aux instructions du fabricant, les expériences ont été réalisées immédiatement après la mise sous tension afin de montrer clairement l’effet. Le graphique de la figure 10 compare l’intensité de la fluorescence du premier et du deuxième échantillon de contrôle avec et sans utilisation du moniteur des performances de microscope.

Les résultats montrent qu’en l’absence de correction effectuée par le moniteur des performances de microscope, les performances sont instables immédiatement après la mise sous tension de l’appareil et les données fluctuent grandement. Au contraire, lorsque les performances sont corrigées, une quantification très précise de la fluorescence a été rendue possible, et ce, même lors d’expériences réalisées sur plusieurs jours.

_{Figure 10 – Variation de l’intensité de la fluorescence d’échantillons de contrôle au cours d’une expérience réalisée sur deux jours}
 

Récapitulatif

Le moniteur des performances de microscope confère au microscope confocal à balayage laser FV4000 des capacités de maintenance semi-automatiques. Ces capacités améliorent l’efficacité des travaux de maintenance et éliminent la nécessité de former d’autres utilisateurs à la maintenance. En outre, le système permet aux responsables de services de microscopie de ne plus passer leur temps à s’occuper de la résolution des problèmes, car il fournit des données exactes et transparentes sur ce qui ne va pas au niveau du système de microscope, ce qui facilite les échanges avec le fabricant et aide à réduire les temps d’immobilisation. Autre avantage, les données fournies par le moniteur des performances de microscope peuvent aider à informer les utilisateurs sur l’importance du préchauffage des équipements, du réglage de la bague de correction de l’objectif et des fluctuations de la puissance du laser en sortie de l’objectif.

Pour les chercheurs utilisant un système de microscope confocal à balayage laser dans leurs expériences, la surveillance des performances du microscope, notamment en ce qui concerne les fluctuations de l’intensité de la fluorescence, avant de réaliser une expérience, peut réduire de manière significative la variabilité de la quantification de la fluorescence, ce qui permet d’acquérir des images et des données quantitatives plus constantes. La capacité de mesure semi-automatique du moniteur des performances de microscope permet de s’assurer que tous les utilisateurs, même les plus novices, peuvent réaliser facilement ces mesures. En outre, si les résultats de l’expérience sont inattendus, le moniteur permet de déterminer si le problème est lié au microscope ou à l’échantillon.

Nous avons la conviction que l’amélioration de la reproductibilité des expériences de chaque utilisateur et de la reproductibilité des articles de recherche est essentielle pour les chercheurs. Dans ce but, EVIDENT poursuivra ses efforts pour améliorer la traçabilité des données de mesure des performances des microscopes.

* Le contenu de cet article technique repose sur les travaux de recherche technique effectués au sein du centre RIKEN CBS-EVIDENT Open Collaboration Center (BOCC).
 

Auteur

Yasuo Yonemaru
Advanced Technology, R&D, Evident Corporation

1. G. Nelson, et al. “QUAREP-LiMi: A community-driven initiative to establish guidelines for quality assessment and reproducibility for instruments and images in light microscopy”, Journal of Microscopy, vol. 284 (1), 56–73, (2021).
2. U. Boehm, et al. “QUAREP-LiMi: A Community Endeavor to Advance Quality Assessment and Reproducibility in Light Microscopy.” Nature Methods, vol. 18, 1423–1426. (2021).
3. H. K. Jambor. “A Community-Driven Approach to Enhancing the Quality and Interpretability of Microscopy Images.” Journal of Cell Science vol. 136 (24), jcs261837, (2023).
5. ISO 21073-2019 “Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging”
6. O. Faklaris, et al. “Quality Assessment in Light Microscopy for Routine Use through Simple Tools and Robust Metrics.” Journal of Cell Biology, vol 221 (11), e202107093, (2022).
7. Lewis, J. P. “Fast Normalized Cross-Correlation.” Industrial Light & Magic, 1995.