Introduction à la méthode de gradient de contraste

1. Introduction

Depuis leur invention au 16^e siècle, les microscopes optiques ont grandement contribué à la recherche biologique, notamment à la découverte des microorganismes et des érythrocytes. Au 19^e siècle, la technologie de coloration des échantillons s’est développée et les structures transparentes pouvaient être colorées avec des agents de contraste de couleurs pour les rendre plus faciles à voir. Malheureusement, la coloration est toxique, ce qui limite son utilisation sur des échantillons vivants. À partir du 20^e siècle, diverses méthodes permettant de voir des objets transparents non colorés, comme la microscopie à contraste de phase, ont été développées, devenant à ce jour des outils indispensables pour la recherche biologique.

2. Les différentes variantes de la méthode de contraste de phase

Les méthodes de visualisation de phase courantes pour observer des objets transparents sans coloration sont brièvement expliquées avec la disposition de leurs éléments optiques illustrée dans la figure 1. Les méthodes de visualisation de phase traditionnelles exigent de positionner des éléments optiques précis dans la pupille du condenseur et la pupille de l’objectif.

La méthode de contraste de phase (figure 1a) combine une lentille de condenseur dédiée avec une ouverture en forme d’anneau et une lentille d’objectif dédiée contenant un anneau de film de phase. Parmi les rayons qui passent par l’ouverture en forme d’anneau du condenseur, ceux qui passent à travers l’échantillon sans être déviés traversent le film de phase de la pupille de l’objectif. Les rayons déviés par l’échantillon en revanche passent à l’extérieur du film de phase, ce qui produit un contraste de lumière et d’ombre au point où les deux composantes interfèrent l’une avec l’autre. Une caractéristique de ce processus est que des taches lumineuses, appelées halos, apparaissent à des endroits où la distribution de l’indice de réfraction change dans l’échantillon. Les échantillons épais ne conviennent pas à cette méthode, car le halo produit est trop important.

La méthode de contraste interférentiel différentiel (figure 1b) utilise un interféromètre à dédoublement polarisé avec des prismes de Wollaston complémentaires au niveau de la pupille du condenseur et de la pupille de l’objectif. L’image de l’échantillon devient une image double légèrement décalée dans une direction fixe, et le saut d’indice de réfraction de l’échantillon est ombré pour le faire apparaître en trois dimensions. Étant donné que l’interférence en lumière polarisée est utilisée, l’observation n’est pas possible s’il y a une boîte de Pétri en plastique ou un autre objet qui provoque une distorsion polarisée dans le trajet optique.

La méthode de contraste par modulation (figure 1c) limite le faisceau d’éclairage dans une direction à l’aide de l’ouverture en forme de fente de la pupille du condenseur. Le guidage du faisceau lumineux fait en sorte que la partie rectiligne de la lumière dans l’échantillon apparaît en gris, tandis que le contraste de la partie réfractée change en fonction de la direction de réfraction grâce au modulateur de la pupille de l’objectif. En transmettant ou en bloquant une partie de la lumière, il est possible d’obtenir une image tridimensionnelle semblable à celle obtenue avec la méthode de contraste interférentiel différentiel. Étant donné que la méthode de contraste par modulation n’a pas recours à la polarisation, on peut utiliser des récipients en plastique, comme des boîtes de Pétri. Cependant, la résolution est légèrement réduite avec cette méthode, car le fait de limiter la direction du faisceau d’éclairage signifie aussi une petite ouverture numérique (ON) d’éclairage.

Figure 1. Disposition des composants optiques de diverses méthodes de visualisation de phase

Les éléments optiques nécessaires pour chacune des diverses méthodes de visualisation de phase. a. Méthode de contraste de phase
b. Méthode de contraste interférentiel différentiel c. Méthode de contraste par modulation d. Méthode de contraste de gradient

3. Méthode de contraste de gradient

La méthode de contraste de gradient (figure 1d) est caractérisée par la génération d’une image pseudo-tridimensionnelle similaire à celle obtenue avec la méthode de contraste interférentiel différentiel. Alors que d’autres méthodes de visualisation de phase nécessitent plusieurs composants optiques pour générer un contraste dans des échantillons non colorés, un contraste de gradient peut être obtenu en insérant simplement un filtre à gradient à densité neutre dans la pupille de l’objectif.

Principe de la méthode de contraste de gradient

Le filtre à gradient à densité neutre inséré au niveau de la pupille de l’objectif a une transmission décroissante monotone dans une direction. Le diamètre d’ouverture de la lentille de condenseur projetée à la position de la pupille de l’objectif est réduit dans une certaine mesure par rapport au diamètre de la pupille de l’objectif. Là où la distribution de l’indice de réfraction de l’échantillon est régulière (partie plate de l’échantillon), l’image de l’ouverture de la lentille du condenseur est projetée à la position centrale de la pupille de l’objectif, l’apparence de l’image finale étant dépendante de la lumière transmise en fonction de la transmittance près du centre du filtre à gradient à densité neutre (figure 2a). Là où la distribution de l’indice de réfraction de l’échantillon est irrégulière (partie inclinée de la surface de l’échantillon), l’angle du faisceau lumineux réfracté par l’échantillon change et l’image de l’ouverture de la lentille du condenseur est décalée par rapport au centre du filtre à gradient à densité neutre vers une partie du filtre où la transmittance globale est différente de celle du centre (figures 2b et c). En conséquence, l’image est acquise à une luminosité correspondant à l’inclinaison de la surface de l’échantillon (partie où l’indice de réfraction varie), et cette surface de l’échantillon paraît tridimensionnelle (figure 2d).

L’ouverture du condenseur peut être réglée à l’aide du diaphragme d’ouverture. Lorsque l’ouverture est relativement importante, le changement de luminosité attribuable à l’inclinaison de la surface de l’échantillon peut ne pas être suffisant. Dans un tel cas, l’image acquise avec le capteur d’image est accentuée et affichée avec un contraste facile à voir.

Figure 2. Illustration du principe de la méthode de contraste de gradient

Description du principe de contraste entre la lumière et l’ombre sur un objet de phase au moyen de la méthode de contraste de gradient. a. Là où la surface de l’échantillon est plane (distribution de phase régulière), le faisceau lumineux n’est pas dévié et passe près du centre du filtre à gradient à densité neutre. b, c. Si la surface de l’échantillon est inclinée (distribution de phase variable), les rayons de lumière sont réfractés en fonction de l’inclinaison et les rayons déviés passent soit par la partie la plus claire du filtre à gradient à densité neutre (b) soit (c) par la partie la plus sombre. d. L’image est observée avec un contraste de lumière et d’ombre selon la direction d’inclinaison de la surface de l’échantillon.

Caractéristiques de la méthode de contraste de gradient

L’image de phase produite par la méthode de contraste de gradient présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes classiques de visualisation de phase. La méthode de contraste de gradient peut être appliquée à des échantillons épais, car il n’y a pas formation de halos contrairement à la méthode de contraste de phase. Comme elle n’est pas basée sur la polarisation, contrairement à la méthode de contraste interférentiel différentiel, la méthode de contraste de gradient peut générer des images pseudo-tridimensionnelles d’échantillons même à travers des récipients en plastique. De plus, étant donné que l’ouverture numérique de l’éclairage est plus grande que celle des autres méthodes, cette méthode est moins sensible aux problèmes causés par l’imagerie à travers le couvercle d’une boîte de Petri avec des gouttelettes d’eau. Cette particularité empêche également la détérioration de la résolution attribuable à l’utilisation d’un élément d’obturation dans la méthode de contraste par modulation. Un autre avantage pratique est qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser un objectif dédié et donc de changer des éléments lors du changement d’objectif, ce qui rend l’observation plus rapide et plus facile.

Configuration optique pour la méthode de contraste de gradient

La configuration optique du système d’imagerie APX100 est illustrée à la figure 3. La lumière est irradiée vers l’échantillon à travers le trajet optique et l’image est formée sur la surface d’imagerie.

Un filtre à gradient à densité neutre est placé à une position qui est conjuguée à la position de la pupille de l’objectif. Ce filtre n’entre dans le trajet optique que lorsque le système est configuré pour la méthode de contraste de gradient. Le diamètre d’ouverture du condenseur est automatiquement réglé à la valeur optimale en fonction du grossissement et du diamètre de la pupille de l’objectif.

Figure 3. Configuration optique du APX100 pour l’observation en contraste de gradient d’échantillons non colorés

Utilisations

Ci-dessous, des cellules HeLa dans les récipients 1 et 2 ont été observées avec un objectif 10x. Les images ont été acquises en utilisant les quatre méthodes d’observation présentées précédemment afin que les images puissent être comparées.

1. Boîte à fond en verre ※ Le couvercle supérieur en plastique est en place
2. Plaque à 12 puits ※ Les gouttelettes d’eau adhèrent au couvercle supérieur en plastique

Comparaison des résultats :

1. L’image obtenue avec la méthode de contraste de gradient est comparable aux images obtenues à l’aide des méthodes de contraste de phase et de contraste par modulation. Dans l’image obtenue avec la méthode de contraste interférentiel différentiel, l’efficacité de la polarisation est réduite avec le couvercle en plastique, de sorte que le contraste est faible.
2. Par rapport aux autres méthodes d’observation, l’image obtenue à l’aide de la méthode de contraste de gradient a un champ de vision plus uniforme et un bon contraste. L’ouverture numérique de l’éclairage est plus grande que celle des autres méthodes d’observation, et elle est moins affectée par les corps étrangers sur l’échantillon et les gouttelettes d’eau dans le récipient.

4. Résumé

La méthode de contraste de gradient est une méthode d’observation d’objet de phase ayant recours à une configuration optique simple qui nécessite seulement l’ajout d’un filtre à gradient à densité neutre au niveau de la pupille de l’objectif. Elle permet une bonne observation des échantillons vivants transparents sans coloration. Voici les avantages de la méthode de contraste de gradient comparativement à la méthode d’observation d’objets de phase traditionnelle :

• Elle convient bien aux échantillons épais
• Elle est efficace sur les échantillons contenus dans une boîte de Pétri en plastique
• Les observations peuvent être faites à travers le couvercle d’une boîte de Pétri, réduisant ainsi le risque de contamination des cellules cultivées
• Elle ne requiert pas d’objectif dédié
• Elle n’exige pas de changer d’élément de condenseur lors du changement d’objectif

Auteurs