Introduction à la microscopie de fluorescence multiphotonique

La microscopie de fluorescence multiphotonique est un outil de recherche puissant qui combine les techniques optiques avancées de la microscopie à balayage laser avec une excitation de fluorescence multiphotonique à grandes longueurs d’onde pour acquérir des images 3D à haute résolution des échantillons marqués par des fluorophores hautement spécifiques.

Figure 1. Configuration d’un microscope à fluorescence à excitation multiphotonique

Cette méthodologie est particulièrement utile pour les biologistes cellulaires qui souhaitent étudier des mécanismes dynamiques dans les cellules et les tissus vivants sans infliger de dommages importants, et souvent létaux, à l’échantillon. Bien que la microscopie de fluorescence classique à champ large puisse souvent produire une résolution inférieure au micromètre des événements biochimiques dans les systèmes vivants, cette technique est limitée en sensibilité et en résolution spatiale par le bruit de fond provoqué par la fluorescence secondaire dans les zones situées au-dessus et au-dessous du plan focal.

L’excitation en microscopie multiphotonique s’effectue uniquement au point focal d’un microscope à diffraction limitée, ce qui permet d’obtenir une coupe optique des échantillons biologiques épais afin de pouvoir faire une reconstitution tridimensionnelle. Les coupes optiques individuelles sont acquises par balayage ligne par ligne de l’échantillon dans le plan x-y, et une image tridimensionnelle complète est composée par un balayage sérié de l’échantillon à des positions z séquentielles. Comme la position du point focal peut être déterminée et contrôlée avec précision, la fluorescence multiphotonique est utile pour sonder des régions sélectionnées sous la surface de l’échantillon. Du fait de l’excitation hautement localisée, le photoblanchiment des fluorophores ainsi que les photodommages de l’échantillon sont réduits, ce qui augmente la viabilité des cellules et donc la durée des expériences servant à étudier les propriétés des cellules vivantes. De plus, l’utilisation d’une source d’excitation dans le proche infrarouge permet une meilleure pénétration dans les matériaux biologiques et réduit le degré élevé de diffusion de la lumière observée avec des longueurs d’onde plus courtes. Tous ces avantages permettent aux chercheurs de réaliser des expériences sur des échantillons épais de tissus vivants, tels que des tranches cérébrales ou le cerveau intact d’un animal in vivo et d’embryons en développement, qui seraient difficiles, voire impossibles, à visualiser avec d’autres techniques de microscopie.

La figure 1 illustre une configuration typique utilisée dans les expériences de microscopie de fluorescence multiphotonique. Le microscope est un instrument de type droit conçu pour observer in vivo les tissus vivants d’un petit animal expérimental. La partie arrière du corps du microscope est un système de laser pulsé à modes synchronisés utilisant des cristaux de titane-saphir, qui est l’une des sources préférées pour l’excitation multiphotonique en raison de l’intensité de crête élevée mais de la faible puissance moyenne. Un système de détection à photomultiplicateur équipé d’un filtre est relié à une position suffisamment proche de la tourelle du microscope pour détecter la fluorescence diffusée effectivement captée par l’objectif. Les images numériques recueillies par le microscope sont traitées et analysées par une station de travail informatique auxiliaire capable d’assembler des reconstructions tridimensionnelles à partir des coupes optiques.

La microscopie à fluorescence à champ large traditionnelle est gênée par la fluorescence secondaire qui se produit loin de la zone focale, car elle contribue à des irisations et à un fort signal de bruit de fond, obscurcissant souvent des détails importants de l’échantillon. La microscopie confocale contourne en grande partie ce problème en rejetant le bruit de fond fluorescent hors de la zone focale grâce à l’utilisation d’ouvertures à sténopé, qui produisent des coupes optiques fines (moins d’un micron) et non floues des parties les plus profondes des échantillons épais. L’introduction de la microscopie de fluorescence multiphotonique offre une alternative à la microscopie confocale grâce à une excitation sélective couplée à une gamme plus large de choix de détection. Contrairement aux microscopes confocaux classiques, le microscope présenté à la figure 1 ne nécessite pas de sténopé près du détecteur pour obtenir une discrimination tridimensionnelle, ce qui augmente considérablement l’efficacité des signaux de fluorescence émis. Dans le passé, le coût élevé et la complexité des systèmes laser pulsés nécessaires à l’excitation multiphotonique ont limité l’utilisation de cette technique. Aujourd’hui, les lasers clés en main et les systèmes multiphotoniques commerciaux ont fait de la microscopie de fluorescence multiphotonique la méthode privilégiée pour de nombreuses recherches.

Excitation à deux et trois photons

Les principes de base de l’excitation multiphotonique ont été décrits pour la première fois par Maria Göppert-Mayer, dans sa thèse de doctorat il y a plus de 70 ans, mais l’hypothèse n’a pu être confirmée qu’après l’invention des lasers à rubis pulsé, environ 30 ans plus tard. À des densités de photons élevées, deux photons peuvent être absorbés simultanément (par l’intermédiaire d’un état virtuel), l’énergie portée par chacun des photons s’additionnant pour provoquer la transition électronique d’un fluorophore à son état excité. L’énergie d’un photon étant inversement proportionnelle à sa longueur d’onde, les deux photons doivent avoir une longueur d’onde environ deux fois supérieure à celle requise pour une excitation à un seul photon. Par exemple, deux photons ayant une longueur d’onde de 640 nanomètres (lumière rouge) peuvent se combiner pour exciter un fluorophore absorbant l’ultraviolet dans la région de 320 nanomètres (ultraviolet), ce qui entraînera une émission de lumière fluorescente secondaire de plus grande longueur d’onde (bleue ou verte). Cette application unique signifie que des longueurs d’onde plus grandes, allant jusqu’à la région infrarouge, peuvent être utilisées de manière pratique pour exciter des chromophores en un seul événement quantique, ces derniers émettant ensuite un rayonnement secondaire à des longueurs d’onde inférieures.

La nécessité d’avoir deux photons pour chaque événement d’excitation nécessite une constante de vitesse qui dépend du carré de l’intensité d’excitation. Bien qu’il ne soit pas nécessaire que les photons soient de longueur d’onde identique pour induire une excitation multiphotonique, la plupart des systèmes expérimentaux sont conçus avec une source laser unique, de sorte que les deux photons sont généralement membres d’une population définie présentant une répartition étroite de longueurs d’onde. Contrairement au cas de l’absorption d’un seul photon, la probabilité qu’un fluorophore donné absorbe simultanément deux photons est fonction du chevauchement spatial et temporel entre les photons incidents. Les calculs basés sur l’hypothèse que chaque fluorophore est exposé à la même section transversale du laser indiquent que les photons doivent arriver à moins de 10^-18 seconde (une attoseconde) les uns des autres. L’échelle de temps de cette période de chevauchement est cohérente avec la durée de vie (10(-17) seconde ou 0,01 femtoseconde) de l’état virtuel intermédiaire.

En fluorescence multiphotonique, de fortes densités de photons sont nécessaires pour assurer un niveau suffisant d’excitation des fluorophores. En fait, la concentration de photons doit être environ un million de fois supérieure à celle requise pour un nombre équivalent d’absorptions d’un seul photon. Pour ce faire, on utilise des lasers pulsés à modes synchronisés de haute puissance, qui génèrent une quantité importante de puissance pendant les crêtes d’impulsion, mais dont la puissance moyenne est suffisamment faible pour ne pas endommager l’échantillon. Les impulsions brèves mais intenses émises par le laser augmentent la probabilité moyenne d’absorption de deux photons pour un fluorophore donné à un niveau de puissance laser incident moyen constant. La réduction du niveau de puissance d’excitation moyen permet de diminuer l’absorption d’un seul photon, qui se produit également dans l’échantillon pendant l’excitation. Ce sont les événements d’excitation à un seul photon qui entraînent la majorité de l’échauffement et une partie des photodommages qui se produisent lors des expériences de fluorescence.

Les configurations typiques de laser pulsé utilisent des cycles actifs courts d’environ 100 femtosecondes (10^-13 seconde) avec un taux de récurrence de 80 à 100 mégahertz pour les expériences de fluorescence multiphotonique. Ce régime permet l’acquisition d’images satisfaisantes sans soumettre l’échantillon à une chaleur excessive et à des photodommages. L’échelle de temps de chaque impulsion, bien qu’elle soit souvent qualifiée d’« ultracourte », reste de quatre à cinq ordres de grandeur supérieure au temps de réaction de l’absorption de deux photons. La population d’états singulet dans les chromophores excités par une impulsion à deux photons est identique à celle obtenue lors d’une microscopie de fluorescence conventionnelle à champ large ou confocale. Par conséquent, l’émission de fluorescence secondaire après une excitation à deux photons est indifférenciable de celle observée dans les expériences à un seul photon. Un fluorophore tel que la rhodamine émettra la même large gamme de longueurs d’onde de fluorescence secondaire, qu’il ait été excité par un événement d’excitation à un ou à deux photons.

L’excitation à trois photons est un événement d’absorption optique non linéaire connexe qui peut se produire de manière similaire à l’excitation à deux photons. La différence est que trois photons doivent interagir simultanément avec le fluorophore pour provoquer une transition vers l’état singulet excité. Dans l’excitation à trois photons, une absorption réussie ne nécessite qu’une concentration de photons dix fois supérieure à celle de l’absorption de deux photons, ce qui rend cette technique intéressante et avantageuse pour certaines expériences. L’excitation à trois photons peut améliorer la résolution selon l’axe z à un degré encore plus élevé que l’absorption de deux photons. Cette amélioration est due à une section transversale plus petite pour l’excitation du fluorophore en raison de l’interaction simultanée avec trois photons individuels. En pratique, un laser émettant de la lumière infrarouge avec une distribution des longueurs d’onde centrée sur 1 050 nanomètres est capable d’exciter un fluorophore qui absorbe dans la région de l’ultraviolet (environ 350 nanomètres, un tiers de la longueur d’onde d’excitation). Le même laser peut simultanément exciter un autre fluorophore à la moitié de la longueur d’onde (525 nanomètres), une combinaison qui s’avère utile dans les expériences biologiques à double marquage.

En utilisant des longueurs d’onde plus courtes dans le proche infrarouge (jusqu’à 720 nanomètres), la fluorescence à trois photons peut étendre la plage d’imagerie de fluorescence utile jusqu’à l’ultraviolet profond. Les longueurs d’onde laser comprises entre 900 et 700 nanomètres exciteront les fluorophores qui absorbent dans la région de 240 à 300 nanomètres, ce qui est pratiquement impossible à réaliser avec les optiques de microscopes classiques. Le verre utilisé dans la fabrication des objectifs à fluorescence présente une très faible transmission pour les longueurs d’onde inférieures à 300 nanomètres, mais le rayonnement laser infrarouge de plus grande longueur d’onde peut facilement le traverser pour produire une excitation à trois photons.

La figure 3 illustre de manière schématique les excitations à un, deux et trois photons d’un acide aminé aromatique commun, le tryptophane. Une transition électronique à un seul photon de 4,5 électronvolts excite le tryptophane à 280 nanomètres et entraîne l’émission d’une fluorescence secondaire à 348 nanomètres dans la région de l’ultraviolet. L’excitation par le mécanisme à deux photons est réalisée avec une lumière jaune-verte centrée à 580 nanomètres, tandis que l’excitation à trois photons se produit lorsque l’acide aminé est éclairé par un rayonnement de 840 nanomètres dans la région du proche infrarouge. Les transitions sont illustrées dans un diagramme de Jablonski (figure 3), où l’état virtuel est représenté par une sphère pour l’excitation à deux photons et par deux sphères pour l’excitation à trois photons. Le tryptophane présente une fluorescence beaucoup plus forte avec un rendement quantique plus élevé que les autres acides aminés aromatiques et n’est présent qu’en petites quantités dans la plupart des protéines. Ces attributs devraient faire de la microscopie multiphotonique un excellent outil pour les recherches utilisant l’autofluorescence des résidus de tryptophane. Des phénomènes non linéaires d’ordre encore plus élevé sont possibles, notamment l’excitation à quatre photons, mais ceux-ci n’ont pas encore été appliqués à la recherche biologique.

Microscopie de fluorescence à deux photons

La localisation de l’excitation dans la région entourant immédiatement le point focal en microscopie multiphotonique se produit parce que c’est à cet endroit que la densité de photons est la plus élevée. Cet avantage découle du principe physique de base selon lequel l’absorption de deux photons par un fluorophore est une fonction du carré de l’intensité de l’excitation. Lorsque les photons provenant d’une source laser pulsée sont focalisés par un objectif à grande ouverture numérique, ils sont plus concentrés, ce qui augmente la probabilité que deux photons ou plus interagissent simultanément avec un seul fluorophore. La concentration de photons au point focal du microscope est tellement critique pour l’absorption multiphotonique que c’est la seule région où se produit une excitation appréciable. Ce concept est présenté dans les figures 2 et 4, qui illustrent respectivement l’excitation multiphotonique à un niveau macroscopique et microscopique. La figure 2 représente une vue exagérée d’un objectif de microscope en position pour visualiser des cellules cultivées sur une lame de microscope et recouvertes d’une lamelle couvre-objet. Les impulsions laser rouges traversent l’axe longitudinal de l’objectif et sont focalisées et concentrées sur la cellule dans la partie centrale de la figure.

La figure 4 illustre la concentration des photons et leur interaction avec les fluorophores au point focal du microscope. Lorsque des impulsions de lumière laser rouge traversent l’échantillon contenant des fluorophores (représentés par un triplet linéaire de sphères), la probabilité d’excitation augmente lorsque les impulsions atteignent le point focal de l’objectif. Les photons individuels sont représentés comme un agrégat séparé dans les lignes rouges diffuses qui définissent les limites des impulsions laser. Un petit groupe de molécules fluorophores positionnées au centre de la région focale de la figure 4 ont été excitées par l’absorption simultanée de deux photons et émettent une fluorescence secondaire verte. La probabilité que les chromophores situés en dehors du plan focal absorbent deux photons est quasiment nulle, car la densité de photons n’est pas assez élevée dans cette région.

Le phénomène d’excitation à deux photons est possible non seulement en raison de la proximité spatiale des fluorophores au niveau du point focal du microscope, mais aussi en raison du chevauchement temporel des photons contenus dans les impulsions laser successives. Comme indiqué plus haut, l’énergie d’excitation dans l’absorption de deux photons est proportionnelle au carré de l’intensité des photons produits par la source laser. L’intensité du faisceau laser pulsé diminue du carré de la distance au plan focal, de sorte que la probabilité d’excitation d’un fluorophore situé n’importe où près de la région focale diminue de la distance du fluorophore au plan focal à la puissance quatre. Les dimensions du cône d’éclairage du laser pulsé sont déterminées par l’ouverture numérique de l’objectif. Ainsi, la diminution de l’intensité du faisceau à partir du point focal est proportionnelle au diamètre au carré du cône de lumière d’excitation. Lorsque le cône d’éclairage s’étend au-dessus et au-dessous du point focal, les probabilités d’excitation des fluorophores diminuent du diamètre du cône à la puissance quatre. De ce fait, l’excitation des fluorophores est confinée à la région immédiate entourant le point focal, qui ne représente qu’une très fine coupe optique de l’ensemble de l’échantillon.

Les durées des impulsions laser, qui vont généralement d’environ 100 femtosecondes à 1 picoseconde (10^-13 à 10^-12 seconde), sont considérées comme ultracourtes à l’échelle macroscopique. Cependant, à l’échelle de temps pour les événements d’absorption de photons (environ un millième de femtoseconde), les impulsions sont en fait d’une durée assez longue. La saturation du fluorophore est ainsi limitée et les molécules ont suffisamment de temps pour revenir à l’état fondamental entre les impulsions avant qu’un autre cycle d’excitation ne se produise. Les taux de récurrence des impulsions varient entre 80 et 120 mégahertz (MHz), ce qui permet d’obtenir une puissance de crête instantanée élevée pour l’excitation suivie d’un temps d’arrêt de 10 nanosecondes en moyenne. Comme la durée de vie de la fluorescence d’un fluorophore typique ne dure qu’environ deux nanosecondes, la population de molécules excitées a largement le temps de se relaxer entre les impulsions. Le cycle actif des impulsions relativement court (durée de l’impulsion divisée par le temps entre les impulsions) limite la puissance laser moyenne d’entrée à une valeur à peine supérieure à celle couramment utilisée pour la microscopie confocale à balayage laser.

La limitation de l’excitation à deux photons à la région proche du plan focal constitue un avantage significatif de la microscopie multiphotonique par rapport à la microscopie confocale. En microscopie confocale, la fluorescence est excitée dans tout l’échantillon, mais la fluorescence secondaire captée par le détecteur est limitée au plan focal de l’objectif par le sténopé confocal. Cela contribue à réduire la quantité de bruit de fond ou de fluorescence provenant d’autres plans focaux qui ajoutent du bruit de fond aux données. La microscopie multiphotonique quant à elle génère une excitation de fluorescence (et par la suite, une émission de fluorescence) uniquement au niveau du plan focal, ce qui élimine à la fois le bruit de fond et la nécessité d’un sténopé confocal. La différence spectaculaire entre les modes d’excitation en microscopie confocale et multiphotonique est illustrée dans la figure 5, avec les profils de photoblanchiment pour chaque technique.

La figure 5 représente les profils de photoblanchiment x-z qui se produisent lors du balayage répété d’un seul plan x-y dans un film de polyformal de vinyle coloré avec un fluorophore, la rhodamine (colorant vert). La figure 5(a), à gauche, représente le profil généré par le balayage du film coloré avec un microscope confocal. Le rectangle blanc au centre du balayage représente le plan focal qui passe à travers le sténopé et est imagé par le détecteur. Les lignes bleues diagonales qui partent des coins supérieur et inférieur du rectangle représentent le trajet lumineux emprunté par le faisceau de lumière d’excitation à travers le film. Lors du balayage ligne par ligne du film, le fluorophore est excité et émet une fluorescence secondaire. Finalement, le photoblanchiment se produit, ce qui est représenté par les zones sombres dans la région focale. Dans le film balayé par le microscope confocal (figure 5(a)), l’excitation intégrée est presque égale tout au long du trajet d’excitation, tant au-dessus et qu’au-dessous du plan focal. À l’inverse, le profil d’excitation du balayage répétitif x-z généré par le microscope multiphotonique limite l’excitation et le photoblanchiment au plan focal (figure 5(b)). Comme dans le cas de la figure 5(a), les lignes bleues diagonales émanant du plan focal délimitent le trajet suivi par la lumière d’excitation pour atteindre le plan focal.

L’excitation localisée que permet la microscopie multiphotonique présente un certain nombre d’avantages. Le plus important est peut-être le haut degré de résolution tridimensionnelle pouvant être atteint avec cette technique, qui est identique à celle obtenue avec un microscope confocal idéal. De plus, l’absence d’absorption des fluorophores situés en dehors du plan focal permet à une plus grande partie de la lumière d’excitation de pénétrer dans l’échantillon et d’atteindre le plan focal. Il en résulte une augmentation spectaculaire de la capacité du faisceau focalisé à pénétrer profondément dans l’échantillon, souvent à une profondeur qui peut être de deux à trois fois supérieure à celle observée avec la microscopie confocale.

Comme nous l’avons vu précédemment, la probabilité d’absorption multiphotonique en dehors de la région focale diminue de la distance le long de l’axe optique (la direction z) à la puissance quatre. Lorsqu’une distribution uniforme de fluorophores est soumise à une excitation multiphotonique avec un objectif à grande ouverture numérique (1,4), environ 80 % de l’absorption se produit dans un espace étroitement défini appelé le volume focal. Les dimensions de ce volume dépendent de l’ouverture numérique de l’objectif, mais pour un objectif à fluorescence typique à grande ouverture aux longueurs d’onde du proche infrarouge, cette zone est définie par un ellipsoïde ayant une dimension latérale de 0,3 micron de diamètre et une longueur axiale de 1 micron.

La quantité de photoblanchiment (et des photodommages associés causés aux cellules et aux tissus) représentée à la figure 5(b) pour la microscopie multiphotonique est nettement inférieure à celle qui se produit avec la microscopie confocale. Le photoblanchiment et les photodommages sont deux des plus importantes limites de la microscopie de fluorescence dans l’étude des cellules, des tissus et autres organismes vivants. L’excitation d’un fluorophore entraîne la transition d’un électron d’un état fondamental à un état énergétique singulet excité. Pendant la relaxation vibratoire de l’état excité, il existe une probabilité que la conversion intersystème se produise vers un état triplet au lieu du retour typique vers l’état fondamental singulet. Les états triplets sont extrêmement réactifs et ont une durée de vie relativement longue, ce qui laisse aux fluorophores dans cet état le temps de réagir avec les cellules vivantes ou de subir une dégénérescence moléculaire ou un réarrangement en une espèce non fluorescente. En outre, les fluorophores excités dans un état triplet peuvent générer de l’oxygène singulet, qui réagira avec une grande variété de groupes fonctionnels sur les biomolécules voisines. La lumière d’excitation doit pénétrer l’échantillon sur tous les plans focaux se trouvant sur le trajet menant au point focal, et la plus grande partie de cette lumière continue à se propager sur une distance considérable au-delà de la région focale. Ainsi, une population de fluorophores excités tout au long du trajet du faisceau, comme c’est le cas en microscopie à champ large et confocale, subira un taux très élevé de photoblanchiment et produira des dommages cellulaires et tissulaires considérables qui peuvent être évités avec la technique multiphotonique.

Bien que les mécanismes exacts des dommages cellulaires induits par l’exposition à la lumière soient mal compris, il a été établi que la réduction des photodommages prolonge considérablement la viabilité des échantillons biologiques étudiés par microscopie de fluorescence. L’exposition à la lumière visible de grande longueur d’onde et au proche infrarouge ne semble pas affecter la viabilité des cellules. Il est donc probable que la majorité des dommages associés à la microscopie multiphotonique proviennent de l’excitation et soient confinés au plan focal.

Détecteurs pour la microscopie multiphotonique

En microscopie multiphotonique, les photons émis par fluorescence secondaire proviennent presque exclusivement du plan focal de l’objectif, ce qui élimine la nécessité d’une détection déscannée (DD) et permet des géométries de détection plus flexibles. Cette polyvalence accrue peut conduire à une amélioration considérable de l’efficacité de la détection de la fluorescence par rapport à la microscopie confocale. Dans un système à détection déscannée, la lumière captée par l’objectif est réfléchie par la surface d’une série de miroirs de balayage avant de passer par un sténopé pour atteindre le détecteur. Tout en augmentant la résolution de l’image, le sténopé confocal entraîne une forte diminution de l’efficacité de la détection et nécessite une exposition plus longue de l’échantillon à l’éclairage incident, ce qui augmente la probabilité de photodommages et de photoblanchiment.

Pour optimiser l’efficacité de la détection, les détecteurs non déscannés (NDD) sont généralement situés à proximité de l’objectif, et le diamètre du trajet lumineux doit être plus grand pour détecter efficacement le signal de fluorescence diffusé en profondeur dans l’échantillon. Le tube photomultiplicateur (PMT) est un détecteur courant pour la microscopie multiphotonique. Lorsqu’il est équipé de détecteurs PMT à l’arséniure-phosphure de gallium (GaAsP), il est possible d’acquérir des images à rapport signal/bruit élevé, même à partir d’une faible fluorescence, grâce à son efficacité quantique supérieure à celle des PMT multi-alcalins standards. Détection chimique, qui génère des images de la distribution des récepteurs à partir du courant ionique dans des cellules en tension imposée.

Figure 6

Résolution en microscopie multiphotonique

La résolution en microscopie multiphotonique n’est pas meilleure que celle de la microscopie confocale, en fait, l’utilisation de longueurs d’onde plus grandes (rouge à proche infrarouge ; 700 à 1 200 nanomètres) se traduit par une fonction d’étalement ponctuel plus importante pour l’excitation multiphotonique. Cela se traduit par une légère réduction de la résolution latérale et axiale. Par exemple, avec une longueur d’onde d’excitation de 700 nanomètres et un objectif à ouverture numérique de 1,3, la résolution latérale observée est d’environ 0,2 micromètre avec une résolution axiale correspondante de 0,6 micromètre. Associées au décalage de Stoke, ces valeurs peuvent être jusqu’à 30 % supérieures à la résolution observée avec la microscopie confocale classique dans des conditions identiques. Dans la pratique, la résolution de la microscopie confocale peut être dégradée par l’ouverture limitée du sténopé, l’aberration chromatique et l’alignement imparfait du système optique, autant de facteurs qui contribuent à réduire les différences de résolution entre la microscopie confocale et la microscopie multiphotonique. En somme, si les structures ne sont pas correctement résolues avec un microscope confocal, elles ne le seront pas mieux (et pourraient même être pires) lorsqu’elles seront imagées avec une excitation multiphotonique.

Lors de la prise d’images numériques ou du comptage de photons avec une résolution spatiale tridimensionnelle, il est essentiel de distinguer l’émission de fluorescence se produisant dans le volume focal de la fluorescence issue du fond. La différenciation entre les deux signaux peut être réalisée par l’instrument (avec un système confocal ou multiphotonique) ou par déconvolution d’un ensemble de données tridimensionnelles. La capacité à distinguer l’émission de fluorescence du plan focal de la fluorescence de fond est définie par le rapport signal sur bruit (S/B), où S est le nombre ou l’intensité des photons recueillis dans le plan focal et B représente les photons provenant du fond (plans non focalisés). En microscopie confocale à balayage, les rapports S/B élevés sont générés par le rejet du bruit de fond par le sténopé confocal. Cependant, dans l’excitation multiphotonique, les rapports S/B sont intrinsèquement élevés car il y a très peu d’excitation en dehors du plan focal. Les calculs de résolution entre les techniques multiphotonique et confocale peuvent être comparés en considérant un sténopé infiniment petit lors des calculs confocaux. Pour les deux techniques, le rapport S/B est généralement supérieur de plusieurs ordres de grandeur à celui de la microscopie de fluorescence classique à champ large.

Il faut également tenir compte du fait que l’excitation multiphotonique permet d’utiliser des fluorophores dont les transitions d’absorption se situent dans la région de l’ultraviolet de faible longueur d’onde. Comme la microscopie confocale est limitée dans sa capacité à exciter des fluorophores en dessous d’environ 340 nanomètres, les chercheurs ont tendance à utiliser des sondes ayant des longueurs d’onde beaucoup plus grandes, avec des résolutions correspondantes plus faibles. Dans les situations critiques, la résolution de la microscopie multiphotonique peut être améliorée en limitant les longueurs d’onde d’imagerie par un sténopé confocal et en utilisant un système de détection à résolution spatiale tel qu’un réseau de photodiodes CCD placé dans un plan d’image balayé.

Caractéristiques d’excitation des fluorophores

Les fluorophores utilisés dans les expériences multiphotoniques doivent être choisis avec autant de soins que ceux destinés aux études monophotoniques. Les sondes doivent avoir de grandes sections transversales d’absorption à des longueurs d’onde appropriées, des rendements quantiques élevés, un faible taux de photoblanchiment et le plus faible degré possible de toxicité chimique et photochimique. Les fluorophores doivent également être capables de supporter un éclairage de haute intensité par la source laser sans dégradation significative. Dans la plupart des cas, pour les expériences à deux photons, les chercheurs ont utilisé les mêmes fluorophores habituels qui sont généralement utilisés comme marqueurs en microscopie à champ large et confocale.

Le spectre d’excitation des fluorophores habituels est fonction du mode d’excitation et de la longueur d’onde des photons incidents. En raison de cette dépendance, le spectre d’absorption à deux photons peut être (et est souvent) très différent du spectre correspondant à un seul photon. Expérimentalement, la majorité des fluorophores qui ont été examinés sont capables d’absorber une excitation à deux photons à deux fois la longueur d’onde de leur absorption maximale d’un photon. Aucune base fondamentale ne permet toutefois de prédire quantitativement le spectre d’excitation à deux photons d’un fluorophore complexe en examinant simplement la section transversale d’absorption d’un photon. Il existe souvent des différences significatives entre les spectres d’excitation à un et à deux photons pour les molécules non symétriques fortement conjuguées, qui sont souvent exploitées en spectroscopie moléculaire pour déduire des informations sur la structure des états excités. Les acides aminés aromatiques tyrosine et phénylalanine, dont les complexes sections transversales d’absorption de deux photons sont très différentes de celles observées par l’excitation à un seul photon, en sont un bon exemple. En revanche, le spectre à deux photons du tryptophane (figure 2) est très similaire au profil observé pour une excitation à un seul photon.

Pour les expériences de reconstruction tridimensionnelle quantitative et de déconvolution, les spectres d’absorption à deux photons des fluorophores doivent être mesurés pour s’assurer que les longueurs d’onde d’excitation sont centrées près des crêtes des bandes d’absorption. Bien que les sections transversales d’absorption de deux photons puissent être calculées, le processus est pour le moins complexe. La mesure expérimentale directe des spectres d’absorption est la méthode privilégiée, mais ces expériences sont difficiles en raison de la faible puissance incidente absorbée par rapport aux fluctuations d’intensité de la source de lumière. Des techniques de lentille thermique et acousto-optiques ont été utilisées pour déterminer les sections transversales d’absorption, mais une méthode plus simple consiste sans doute à examiner l’émission de photons par des fluorophores dont le rendement quantique est connu. Lors de la conception de nouvelles expériences à deux photons, il convient d’examiner une gamme de fluorophores présentant des crêtes d’absorption proches de la moitié de la longueur d’onde d’excitation prévue.

La figure 7 présente les caractéristiques des spectres d’excitation de fluorescence à deux photons mesurés pour un certain nombre de fluorophores courants. Les données de la figure 7 représentent les sections transversales d’une action à deux photons, qui sont obtenues en faisant le produit du rendement quantique (QE) de l’émission de fluorescence et de la section transversale d’absorption de deux photons. Les spectres ont été enregistrés en utilisant une lumière polarisée linéairement émise par un laser titane-saphir à modes synchronisés. Dans chaque spectre, le point noir représente deux fois la longueur d’onde du maximum d’absorption d’un seul photon du fluorophore. Le tableau 1 fournit la signification des codes des noms à deux lettres indiqués à côté de chaque spectre dans la figure 7. Les courbes représentent les sections transversales spectrales de l’excitation à deux photons du fluorophore.

Spectres d’excitation de fluorescence à deux photons de divers fluorophores

Tableau 1

Les mesures de la section transversale indiquent une tendance dans laquelle la crête d’excitation pour l’absorption de deux photons est très similaire à celle du profil absorption d’un seul photon décalée vers le bleu (figure 7). Les longueurs d’onde moyennes plus courtes peuvent être avantageuses pour coupler l’excitation du fluorophore à la gamme de longueurs d’onde disponible des lasers à modes synchronisés. Une autre caractéristique constante des spectres d’absorption de deux photons est qu’ils sont généralement beaucoup plus larges que les spectres d’absorption d’un seul photon. Cette caractéristique allège les contraintes expérimentales en augmentant la gamme de longueurs d’onde qui conviennent à l’excitation et améliore la capacité à exciter simultanément deux fluorophores dont les sections transversales d’absorption de deux photons se chevauchent, mais ont des spectres d’absorption d’un seul photon très séparés. Les mesures des sections transversales d’absorption de trois photons indiquent qu’elles sont, en général, très similaires aux spectres d’absorption d’un seul photon correspondants.

Bien que les spectres d’absorption diffèrent souvent pour l’excitation à un ou deux photons, d’autres propriétés de la fluorescence, telles que la durée de vie, les longueurs d’onde d’émission et le taux de conversion intersystème, ne semblent pas être affectées. Cette similitude indique que les mêmes états excités de fluorescence sont atteints par absorption linéaire ou non linéaire, et qu’une fois que le fluorophore a été excité, il se comporte de la même manière quel que soit le mode d’excitation. Ces principes s’appliquent également à l’excitation à trois photons, ce qui permet aux chercheurs d’utiliser des méthodes ratiométriques et spectroscopiques bien établies dans la majorité des expériences multiphotoniques.

Photodommages et dommages thermiques dans l’excitation multiphotonique

Toutes les formes de microscopie de fluorescence entraînent des photodommages des cellules vivantes, dont le degré dépend de la longueur d’onde d’excitation, de la durée d’exposition et de la nature chimique des fluorophores utilisés comme sondes cellulaires. Les dommages induits par l’éclairage d’excitation peuvent être séparés en deux catégories : les dommages thermiques et la dégradation due aux réactions chimiques. Les effets secondaires photochimiques causés par des réactions biochimiques, suite à l’excitation des fluorophores, ne sont pas bien compris et varient largement entre les types de cellule et de tissu. Les dommages thermiques, quant à eux, résultent principalement de deux mécanismes qui se produisent en raison de l’absorption d’un seul photon par l’eau et de l’absorption de deux photons par les fluorophores dans la région focale.

Dans la plupart des cellules étudiées (en particulier les cellules de mammifères), il n’existe pratiquement aucune absorption du rayonnement d’excitation en proche infrarouge de grande longueur d’onde par les fluorophores intrinsèques utilisés en fluorescence multiphotonique. Cependant, l’eau intracellulaire et intercellulaire entourant les cellules et les tissus peut absorber des quantités significatives de rayonnement infrarouge et proche infrarouge, ce qui produit un excès de chaleur qui est potentiellement dommageable pour la viabilité des échantillons biologiques. En revanche, lorsque l’environnement biologique aqueux est éclairé avec les longueurs d’onde plus courtes de la lumière visible et de l’ultraviolet utilisés en microscopie confocale et en microscopie de fluorescence à champ large, une quantité importante de chaleur n’est pas absorbée par l’eau environnante.

Le réchauffement dû à l’absorption monophotonique par l’eau se produit tout au long du trajet du faisceau, tant au-dessus qu’au-dessous du plan focal. Dans des conditions multiphotoniques moyennes contrôlées, il a été calculé que l’augmentation de température induite se situe respectivement entre 0,065 et 1,1 degré centigrade à 700 et 1 000 nanomètres. Ces calculs concordent avec les mesures de chaleur effectuées à 1 064 nanomètres avec une excitation laser de type pince optique. Lorsque le faisceau lumineux d’excitation est maintenu stationnaire, un réchauffement plus important, augmentant rapidement dans une relation logarithmique avec le temps, peut se produire. Dans les expériences d’excitation multiphotonique, le réchauffement dû à l’absorption du fluorophore est majoritairement localisé dans la région focale. Le dégagement thermique en résultant se produit uniformément dans une région à symétrie sphérique entourant le volume focal et ne produit pas de quantité significative de chaleur, même à de fortes concentrations de fluorophore.

Conclusions

La microscopie de fluorescence multiphotonique est en train de devenir l’une des méthodes de choix pour l’imagerie dynamique des cellules et des tissus d’animaux de laboratoire vivants. Cette technique est particulièrement utile pour observer la dynamique des cellules situées profondément dans l’échantillon. De plus, les effets secondaires tels que le photoblanchiment et les photodommages sont limités en excitation multiphotonique et ne se produisent que dans la région immédiate entourant le volume focal.

La phototoxicité dans les cellules est un phénomène mal compris, mais qui se produit dans une large mesure dans la plupart des formes de microscopie de fluorescence. L’énergie quantique et l’absorption intrinsèque plus faibles des grandes longueurs d’onde utilisées en microscopie multiphotonique permettent de réduire les effets néfastes de la lumière sur les cellules et les tissus vivants et ouvrent ainsi la voie à l’étude de la dynamique cellulaire. L’un des principaux obstacles à la recherche en microscopie multiphotonique est le coût élevé des équipements, en particulier les systèmes laser pulsés à modes synchronisés nécessaires à l’excitation à deux et à trois photons. Les systèmes laser ultrarapides les plus répandus sont les lasers titane-saphir. L’accordabilité en longueur d’onde du laser pulsé titane-saphir (700 à 1 300 nanomètres) le rend beaucoup plus polyvalent. Cette disponibilité favorisera l’application généralisée de cette technique dans l’ensemble des sciences biologiques.