Objectifs pour microscopes confocaux

Dans toute configuration de microscope optique classique, l’objectif est le composant le plus critique du système dans la mesure où il détermine le contenu informatif de l’image. Le contraste et la résolution des détails fins de l’échantillon, la profondeur à l’intérieur de l’échantillon à partir de laquelle des informations peuvent être recueillies et l’étendue latérale du champ d’image sont autant de paramètres qui sont déterminés par la façon dont l’objectif est conçu et par ses performances dans les conditions particulières utilisées pour l’observation. Des exigences supplémentaires sont imposées à l’objectif dans les techniques de balayage confocal, dans lesquelles ce composant d’imagerie essentiel va également servir de condenseur pour l’éclairage et va souvent devoir fonctionner avec une haute précision sur une large plage de longueurs d’onde et à des niveaux de lumière très faibles sans introduire de bruit inacceptable quant à la dégradation de la qualité de l’image.

Quelle que soit la fonction de tout autre composant du système, aucune information ne peut être ajoutée à l’image si elle n’a pas été d’abord captée par l’objectif. Certains composants intermédiaires placés dans le trajet d’imagerie peuvent exécuter des fonctions correctives, mais le critère principal quant à leurs performances est qu’ils dégradent le moins possible les informations fondamentales de l’image qu’ils reçoivent de l’objectif. Traditionnellement, les principales variables prises en compte dans le choix d’un objectif pour une application particulière étaient le grossissement, la compatibilité avec une observation à sec ou en immersion, et l’ouverture numérique du système d’objectif. Le développement de nouvelles techniques d’imagerie, rendues possibles par les améliorations technologiques apportées aux lasers, par les fluorochromes et par les nouvelles capacités de marquage des échantillons, ainsi que les améliorations optiques continues des fabricants de microscopes ont considérablement amélioré les avancées dans certains domaines de recherche. Cela est particulièrement vrai dans les domaines de la biologie cellulaire et moléculaire et des neurosciences, et le microscope confocal combiné aux techniques de fluorescence est largement utilisé en tant qu’outil de recherche.

La figure 1 représente un objectif à haute performance conçu spécifiquement pour une utilisation avec un éclairage laser dans les régions du spectre allant du violet au proche infrarouge. L’objectif est un modèle à immersion dans l’huile apochromatique à champ plat (plan) de grossissement 60X corrigé pour les longueurs d’onde allant de 405 à 1000 nanomètres. Parmi les applications pour lesquelles cet objectif est utile, on peut citer les observations simultanées de fluorescence et en contraste interférentiel différentiel (CID).

Si les exigences générales imposées à l’objectif dans un instrument confocal sont similaires à celles d’autres applications de microscopie critiques, les exigences toujours plus nombreuses imposées par les nouvelles techniques ont rendu plus courant que jamais de s’approcher des limites de performance de ces systèmes d’objectifs. Les limites spécifiques de certaines applications ont fait apparaître le fait que d’autres caractéristiques de l’objectif peuvent être aussi importantes, voire plus importantes, que celles traditionnellement considérées comme étant primordiales. Afin de répondre aux besoins essentiels des techniques actuellement prometteuses, les fabricants ont introduit de nouveaux composants optiques visant spécifiquement à optimiser les performances de ces méthodes. Le développement d’objectifs à immersion dans l’huile de silicone hautement corrigés à grande ouverture numérique est un bon exemple de la réponse apportée à l’augmentation spectaculaire de la recherche sur les cellules et les tissus vivants, qui est par nécessité menée dans des milieux aqueux. Il est possible que certains besoins spécifiques en matière de microscopie confocale conduisent au développement de composants optiques qui corrigent moins rigoureusement une ou plusieurs aberrations compromettant la résolution pour privilégier d’autres propriétés plus cruciales pour les performances confocales.

La résolution des microscopes à balayage laser

Il est généralement admis que la résolution des systèmes optiques est la distance de séparation minimale entre deux éléments de l’échantillon qui permet de les distinguer l’un de l’autre dans l’image finale. Définie sur la base d’un contraste spécifique requis pour permettre la reconnaissance visuelle, la résolution peut être quantifiée en fonction de la longueur d’onde lumineuse (λ) et de l’ouverture numérique (ON) du système optique. L’interférence entre les fronts d’onde diffractés lors du passage par l’ouverture de l’objectif produit la distribution d’intensité de la tache d’Airy dans le plan de l’image, dont le diamètre (d) est donné par l’équation suivante dans un système idéal avec une diffraction limitée :

d_Airy= 1,22 • λ/ON

Le critère de Rayleigh bien connu considère deux points identiques comme à peine perceptibles lorsqu’ils sont séparés par la moitié du diamètre de la tache d’Airy. Par conséquent, le rayon d’Airy (r) est équivalent à la résolution latérale et est défini en modifiant l’équation précédente. En épifluorescence, l’objectif sert à la fois de condenseur et d’objectif, et par conséquent, dans l’expression suivante, ON représente l’ouverture numérique de l’objectif :

r_Airy= 1,22 • λ/(2 • NA)

La diffraction limitée qui entraîne une redistribution latérale de l’intensité des objets ponctuels en taches d’Airy produit également une défocalisation le long de l’axe optique, ce qui modifie la taille et la forme du point d’image. La fonction d’étalement tridimensionnel du point d’intensité décrit la distribution de l’intensité et représente les performances du système optique en matière de transfert des informations de l’échantillon au plan de l’image. Diverses aberrations optiques sont caractéristiques des systèmes d’objectifs réfractifs, et celles qui ne sont pas corrigées par la conception de l’objectif ou compensées par un autre composant optique vont modifier la distribution de l’intensité qui représente chaque point de l’échantillon dans l’image et dégrader l’image par rapport à l’image qui serait obtenue avec un système idéal à diffraction limitée. L’importance relative des aberrations potentielles dans les applications confocales doit être prise en compte lors du choix des objectifs pour la technique envisagée. Les principaux facteurs influant la conception et les performances des objectifs, en ce qui concerne spécifiquement le microscope confocal, sont abordés dans les sections suivantes.

La configuration de microscope confocal la plus utilisée pour les applications biologiques se sert d’un système de balayage contrôlé par ordinateur pour dévier un faisceau laser d’éclairage, focalisé par l’objectif, sur un échantillon immobile. On parle de balayage confocal hors axe, car le faisceau de balayage est dévié de chaque côté de l’axe optique et utilise les régions périphériques des éléments de l’objectif. Certaines des premières mises en œuvre de techniques de balayage au microscope optique utilisaient le balayage dans l’axe, dans lequel le faisceau laser restait fixé sur l’axe optique et le balayage était effectué par déplacement de la platine à échantillon ou de l’objectif.

Bien qu’en principe ces deux méthodes de balayage puissent produire des résultats similaires, les critères de choix d’un objectif pour profiter de performances optimales sont significativement différents entre le balayage par le faisceau d’éclairage hors axe et dans l’axe, et les facteurs à prendre en compte pour le captage par l’objectif de la fluorescence émise diffèrent également. Un troisième type de balayage utilise un disque de Nipkow rotatif pour balayer l’échantillon avec de nombreux points d’éclairage sans déplacer la source lumineuse ou la platine du microscope. Les systèmes de Nipkow sont appréciés pour les études sur les cellules vivantes en raison de leur capacité à minimiser les dommages cellulaires par rapport aux configurations utilisant des sources de laser à haute intensité pour le balayage.

Les aberrations au niveau des lentilles qui affectent les performances de l’objectif peuvent être divisées en deux catégories : les aberrations non chromatiques (invariables d’une longueur d’onde à l’autre) et les aberrations chromatiques qui dépendent de la longueur d’onde. Les aberrations chromatiques sont de deux types, aberration chromatique latérale ou aberration chromatique longitudinale, et le groupe d’aberrations indépendantes de la longueur d’onde comprend les aberrations sphériques, la coma, l’astigmatisme, la courbure de champ et la distorsion. Les aberrations chromatiques et les aberrations sphériques affectent l’ensemble du champ de l’image, tandis que les autres aberrations sont plus fréquentes dans les régions en dehors de l’axe. Ce sont les aberrations chromatiques et sphériques (voir la figure 2) qui sont le plus susceptibles d’affecter négativement la performance confocale. En général, les aberrations chromatiques ne peuvent pas être modifiées en réglant le microscope et doivent être atténuées en jouant sur la conception des composants optiques. D’autres artefacts, en particulier les aberrations sphériques, sont souvent aggravés par une utilisation incorrecte de l’objectif ou l’introduction de composants optiques incompatibles, mais peuvent être réduits ou compensés en appliquant les bonnes techniques ou en ajustant le système optique.

Les aberrations sphériques

Les aberrations sphériques sont les aberrations non chromatiques qui affectent le plus les performances confocales. Elles sont une manifestation de la propriété des composants sphériques de l’objectif qui provoque la focalisation des rayons de lumière paraxiaux et périphériques dans des plans successifs. Un degré variable de réfraction pour les trajets des rayons à travers les différentes zones de l’objectif entraîne un flou de l’image focalisée d’une source ponctuelle et produit un changement d’intensité asymétrique au-dessus et au-dessous du plan focal. Dans tous les objectifs modernes, les aberrations sphériques sont corrigées à des niveaux visuellement imperceptibles si les variables de fonctionnement spécifiées pour la conception de l’objectif sont exactement satisfaites. Malheureusement, dans la pratique, il existe plusieurs possibilités de s’écarter des critères établis pour la conception du système optique de l’objectif et d’induire des aberrations sphériques. Les aberrations sphériques ne pouvant être corrigées de manière adéquate que pour une relation de distance précise entre l’objectif et l’échantillon et les plans d’image, l’artefact peut être introduit par inadvertance si la longueur de tube spécifiée pour l’objectif n’est pas respectée. Cela peut se produire si l’objectif est utilisé sur un microscope dont la longueur de tube n’est pas la longueur requise dans un système corrigé à une distance finie, ou en cas d’introduction d’éléments optiques, tels que des filtres, dans le trajet du faisceau convergent d’un tel système.

La correction optimale de l’aberration sphérique nécessite de porter une attention particulière au support d’imagerie externe à l’objectif, qui constitue une autre source potentielle de dégradation des performances. Les caractéristiques de l’objectif sont déterminées par sa conception et on ne peut pas s’attendre à ce qu’elles s’adaptent à diverses conditions d’utilisation (à l’exception des réglages permis par les bagues de correction). Parmi les facteurs qui peuvent ajouter une aberration sphérique importante, citons l’huile d’immersion de mauvaise qualité entre l’objectif et l’échantillon, l’épaisseur non standard de la lamelle couvre-objet, le milieu de montage de l’échantillon et enfin l’échantillon lui-même. Tout matériau qui pénètre entre l’échantillon et la surface de la lentille avant de l’objectif devient un composant critique du système d’imagerie. Le respect des critères établis pour la conception de l’objectif devient encore plus crucial lorsque l’ouverture numérique est grande. Des variations de l’épaisseur de la lamelle ou de son indice de réfraction peuvent augmenter l’aberration sphérique, en particulier avec les objectifs « secs » (sans immersion). Les objectifs secs à grande ouverture numérique sont généralement conçus pour présenter des performances optimales avec une lamelle couvre-objet de 0,17 millimètre d’épaisseur, l’échantillon étant monté directement sous le verre et en contact avec celui-ci.

Pour permettre la correction de l’aberration sphérique en cas d’utilisation d’une épaisseur de lamelle non standard, de nombreux objectifs sont équipés d’une bague de correction réglable qui permet d’ajuster la correction pour une certaine plage d’épaisseurs. La bague de correction opère en translatant un groupe de lentilles interne de façon à modifier la distance focale de l’objectif. Même si une lamelle de la bonne épaisseur est utilisée, la présence d’une couche de milieu de montage entre le verre et l’échantillon va créer un écart par rapport à la situation optique idéale et augmenter le degré d’aberration sphérique. La bague de correction peut également être utilisée pour minimiser l’aberration sphérique induite par les changements d’indice de réfraction de cette nature, qui, en microscopie confocale, entraînent une réduction de l’intensité au niveau du sténopé et une réduction de la discrimination en profondeur en raison de décalages au niveau de la mise au point axiale.

Les objectifs destinés à l’immersion dans l’huile sont généralement optimisés pour une utilisation avec une lamelle de 0,17 millimètre d’épaisseur et d’indice de réfraction 1,518 à des longueurs d’onde spécifiées et avec une huile d’immersion d’indice de réfraction défini précisément. En spécifiant les conditions de fonctionnement par rapport à la lamelle et au milieu d’immersion, l’aberration sphérique peut être corrigée en jouant sur la conception de l’objectif pour plusieurs valeurs de longueur d’onde (selon le type d’objectif). L’importance de faire en sorte que les indices de réfraction de chaque matériau tout au long du trajet optique, de l’échantillon à la lentille avant de l’objectif en passant par le milieu de montage, soient le plus proches possible a toujours été l’un des critères les plus problématiques pour l’imagerie, en particulier pour tenter d’arriver à une haute résolution avec des échantillons biologiques. L’indice de réfraction des composants subcellulaires est considérablement plus faible que celui des milieux d’immersion conventionnels et, dans de nombreux cas, ces indices de réfraction sont incertains et varient d’un endroit à l’autre de l’échantillon. Même dans les échantillons fixés, l’indice de réfraction du milieu de montage n’est généralement pas identique à celui des huiles d’immersion disponibles.

Dans les études des processus dynamiques à l’œuvre dans les cellules vivantes, qui sont cultivées et maintenues dans une solution physiologique, la différence entre les indices de réfraction de l’huile et de l’eau entraîne une limitation critique de la performance des objectifs à immersion dans l’huile. Le problème principal tient dans le fait que le plein potentiel des objectifs à immersion dans l’huile présentant l’ouverture numérique la plus grande n’est pas atteint en raison de la différence entre l’indice de réfraction de l’eau (1,33) et celui de l’huile d’immersion (environ 1,5). Un facteur critique pour l’application de la microscopie confocale est l’amélioration de l’imagerie de fluorescence et de la représentation tridimensionnelle des échantillons épais, et l’aberration sphérique introduite lorsque des objectifs à immersion dans l’huile sont utilisés avec des échantillons aqueux limite la profondeur dans le milieu à laquelle il est possible d’obtenir des images acceptables. En général, les objectifs à immersion dans l’huile avec une grande ouverture numérique sont conçus pour être utilisés à des plans d’image à pas plus que 15 à 20 microns sous la lamelle. Toutefois, lorsqu’ils sont utilisés sur des échantillons aqueux, l’aberration sphérique induite au niveau de l’interface eau-lamelle peut atteindre des niveaux importants à des profondeurs jusqu’à 10 microns. À titre d’exemple, les fonctions d’étalement ponctuel représentées à la figure 3 illustrent le degré croissant d’aberration sphérique qui se produit avec un objectif à immersion dans l’huile plan-apochromatique à des profondeurs de pénétration allant de zéro à huit microns.

L’intérêt d’utiliser des techniques de fluorescence confocale pour recueillir des données tridimensionnelles d’échantillons biologiques aqueux a constitué l’incitation principale pour que les fabricants de microscopes développent un certain nombre d’objectifs hautement corrigés à grande ouverture numérique à immersion dans l’eau. Mais l’eau présente deux inconvénients : elle sèche facilement, ce qui n’est pas pratique pour l’imagerie à intervalles sur de longues durées, et elle a un faible indice de réfraction (1,33) et ne peut donc pas être utilisée comme milieu d’immersion dans la conception d’objectifs à grande ouverture numérique. C’est pourquoi les fabricants ont introduit l’objectif à immersion dans l’huile de silicone qui a un indice de réfraction de 1,4 proche de celui des cellules vivantes et qui ne sèche pas. L’aberration sphérique est une limite optique majeure dans les études confocales des cellules vivantes lorsque des objectifs à immersion dans l’huile sont utilisés, et ses effets augmentent proportionnellement à la profondeur d’observation dans les milieux aqueux et les composants subcellulaires variables (voir la figure 3). Parmi les effets négatifs sur les images, on peut citer la perte de contraste et d’intensité du signal due à une réduction de la fraction de l’intensité de fluorescence émise atteignant le sténopé du détecteur, la perte de résolution sur les éléments de l’échantillon extrêmement petits et la réduction de la précision de la position sur l’axe Z, qui affecte l’intégrité des reconstructions d’images tridimensionnelles. En utilisant des objectifs à immersion dans l’huile de silicone pour l’imagerie d’échantillons en milieu aqueux à une profondeur importante sous la lamelle couvre-objet, la dégradation liée à l’aberration sphérique peut être évitée ou minimisée, ce qui permet d’exploiter pleinement la technique confocale. Comme les objectifs à immersion dans l’huile de silicone ont de longues distances de travail, ils sont capables de recueillir des données tridimensionnelles précises à des profondeurs de plus de 200 microns en milieu aqueux.

Un objectif à immersion dans l’huile, quel que soit le degré de correction optique, n’est pas le choix idéal pour réaliser des images d’un échantillon immergé dans l’eau. Avec cette combinaison, une qualité d’image optimale n’est possible que pour les régions de l’échantillon en contact direct avec la lamelle couvre-objet. À plus grande profondeur, les effets de l’aberration sphérique dégradent le contraste et la résolution et réduisent la luminosité de l’image au point que le rapport signal confocal/bruit est considérablement réduit. La solution optimale pour minimiser l’aberration sphérique induite lors de la réalisation d’images à de grandes distances en milieu aqueux consiste à utiliser un objectif à immersion dans l’huile de silicone hautement corrigé.

L’une des tactiques utilisées pour corriger l’aberration sphérique consiste à installer des bagues de correction sur les objectifs à immersion dans l’eau et l’huile de silicone. Ces bagues de réglage assurent une correction variable des aberrations sphériques, telles que celles induites par les fluctuations d’épaisseur des lamelles couvre-objet. Ce type de bague de correction est également utile pour compenser les différences d’indice de réfraction des milieux physiologiques et des constituants des cellules et des tissus, ainsi que les variations de l’indice de réfraction en fonction des changements de température ou de concentration du soluté. En raison de la variété des facteurs qui peuvent contribuer aux aberrations sphériques induites, une bague de correction réglable est une fonctionnalité souhaitable sur un objectif utilisé pour les applications confocales, même en cas d’utilisation d’une lamelle d’épaisseur optimale.

Les aberrations optiques hors axe

L’aberration optique communément rencontrée appelée la coma affecte principalement les sources de type ponctuel loin de l’axe optique et produit une distorsion radiale des points d’image sous forme de raies, qui augmente en sévérité avec l’angle de champ (voir la figure 4). La coma est quelque peu semblable à l’aberration sphérique en ce sens que toutes deux sont potentiellement induites par les mêmes facteurs. Cette aberration est généralement bien corrigée dans les systèmes optiques modernes par l’utilisation de lentilles appropriées, et les objectifs dans lesquels la coma et l’aberration sphérique sont éliminées sont classés comme aplanétiques. Comme la coma est principalement une aberration en dehors de l’axe, son effet est surtout important pour les systèmes confocaux à balayage laser, qui utilisent généralement des trajets de faisceau hors axe, mais n’est pas un problème pour les microscopes confocaux à balayage dans l’axe par déplacement de l’échantillon.

Plusieurs autres types d’aberrations géométriques ont un impact potentiellement significatif sur les performances des objectifs confocaux, et comme toutes sont plus évidentes dans les régions du champ d’image les plus éloignées du centre, elles sont plus susceptibles d’affecter les performances des systèmes confocaux à balayage laser. Les exigences optiques de l’imagerie confocale sont telles que seuls les objectifs hautement corrigés sont susceptibles de fonctionner correctement, et les aberrations géométriques significatives auront généralement été minimisées dans les objectifs de cette catégorie. Il est cependant bénéfique de connaître ces aberrations et les problèmes potentiels qu’elles peuvent introduire au moment de choisir un objectif, surtout si des caractéristiques de performance spécifiques sont sacrifiées au profit de l’optimisation d’une autre variable potentiellement plus importante pour une utilisation particulière.

L’astigmatisme non corrigé peut réduire l’intensité, la netteté et le contraste de l’image, avec des effets croissants à mesure que l’on s’éloigne de l’axe optique (figure 4). La géométrie d’un point d’image astigmatique peut être définie en considérant deux plans orthogonaux constituant des coupes transversales du front d’onde de l’image. Les plans (tangentiel et sagittal) d’un système astigmatique peuvent avoir des distances focales différentes et présenter des rayons séparés pour un point d’échantillon parfaitement symétrique. Cette aberration se traduit par le fait que des éléments ponctuels symétriques situés hors de l’axe se retrouvent allongés radialement ou tangentiellement dans le plan de l’image, en fonction de la mise au point. Lorsque la meilleure mise au point est choisie à une position de compromis entre les deux extrêmes, la tache d’Airy résultante n’est pas symétrique, ce qui entraîne une dégradation de l’image. L’astigmatisme peut résulter d’éléments mal centrés dans un objectif de faible qualité ou endommagé, et il est augmenté par d’autres problèmes d’alignement dans le trajet optique du microscope.

Une propriété des objectifs décrite comme la courbure du champ ou la planéité du champ est également une préoccupation majeure en imagerie confocale dans le cas d’une imagerie à champ de vision large, en particulier de coupes tissulaires. Les lentilles sphériques simples focalisent les points d’image de différentes régions d’un échantillon plat sur une surface d’image incurvée, qui reflète la forme de la surface de la lentille. Un plan d’image plat n’est pas conforme au plan de focalisation courbe, ce qui a pour conséquence qu’il n’est pas possible de faire simultanément la mise au point sur les zones centrales et périphériques du champ. Des conceptions d’objectif plus complexes, composées de plusieurs groupes de lentilles, sont nécessaires pour corriger cette courbure de champ et permettre une mise au point correcte sur une zone centrale plus grande. Les objectifs désignés comme à champ plat ou plans sont corrigés optiquement pour produire un champ utilisable de bonne largeur d’une parfaite netteté du centre jusqu’à la périphérie, avec une courbure minimale du champ au niveau du plan d’image intermédiaire. La planéité du champ au niveau du plan d’image final dépend également des éléments optiques intermédiaires, y compris les oculaires du microscope.

La non-linéarité du grossissement du centre jusqu’à la périphérie du champ d’image produit une distorsion géométrique des éléments de l’échantillon, ce qui entraîne la déformation de leurs profils dimensionnels réels dans l’image. S’il est présent, cet effet s’observe facilement lorsque l’on prend l’image d’ensembles orthogonaux de lignes qui se croisent : plutôt que d’apparaître droites sur l’ensemble du champ d’image, les lignes sont courbées vers l’extérieur ou vers l’intérieur dans les régions éloignées du centre du champ. Ces deux types de distorsion sont communément appelés distorsion en barillet et distorsion en coussinet, respectivement. Comme c’est le cas pour la courbure de champ, de petites quantités de distorsion géométrique ne constituent généralement pas un problème très important dans les applications biologiques, mais elles peuvent être déterminantes dans les études en science des matériaux si une analyse des défauts ou des mesures précises sont prévues.

Les aberrations chromatiques

Les aberrations chromatiques sont causées par deux phénomènes optiques fondamentaux qui sont dépendants de la longueur d’onde et produisent différents types de défauts d’image. Le premier type d’aberration chromatique est causé par le fait que les indices de réfraction de tous les verres optiques varient en fonction de la longueur d’onde, tandis que le second résulte de la variation du grossissement en fonction de la longueur d’onde. La relation de dépendance entre l’indice de réfraction et la longueur d’onde (généralement appelée dispersion) produit une différence de longueur focale effective pour la lumière de différentes longueurs d’onde. Par conséquent, pour un objectif simple composé d’une seule lentille de verre, une seule longueur d’onde (ou une plage étroite de longueurs d’onde) peut être focalisée avec précision sur le plan de l’image à un réglage donné de la mise au point. Les autres longueurs d’onde seront focalisées plus près ou plus loin de l’objectif. La dispersion spectrale qui en résulte le long de l’axe optique est appelée aberration chromatique longitudinale ou aberration chromatique axiale (voir la figure 5). Dans le cas d’une source ponctuelle dont l’image est prise sur l’axe optique, la gradation des indices de réfraction fait que la lumière bleue est focalisée au plus près de l’objectif, tandis que les longueurs d’onde plus grandes convergent en des points focaux de plus en plus éloignés de l’objectif. L’aberration, si elle n’est pas corrigée, peut s’observer sous forme de franges de couleurs variables lorsque l’on fait varier la mise au point du microscope de part et d’autre de la meilleure mise au point visuelle.

L’aberration chromatique longitudinale non corrigée dans un objectif utilisé pour la microscopie confocale peut avoir des effets très importants, en particulier lors de l’imagerie de deux ou plusieurs fluorophores, qui dépend de la capacité de mettre en évidence la colocalisation de l’émission de fluorescence à plusieurs longueurs d’onde. Lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés, l’aberration chromatique longitudinale entraîne la focalisation des différents faisceaux laser d’excitation à différents points de l’échantillon et, de façon similaire, le captage des différentes longueurs d’onde d’émission depuis des points non coïncidents. Cette aberration abolit la possibilité d’établir les positions précises des fluorophores dans la direction Z pour générer des données tridimensionnelles de l’échantillon.

Dans les techniques de balayage en microscopie confocale, l’évaluation de l’effet des aberrations chromatiques d’un objectif donné sur l’intégrité des images nécessite la prise en compte de tous les facteurs qui déterminent l’énergie du signal qui passe par le sténopé avant d’être enregistrée par le détecteur. Ces facteurs comprennent le spectre d’émission du laser d’excitation, le pic d’émission et la largeur de bande de chaque fluorophore et la sensibilité spectrale du détecteur. La correction de l’aberration chromatique longitudinale est généralement réalisée en jouant sur la conception de l’objectif par la combinaison de diverses lentilles de caractéristiques optiques différentes. Le degré de correction fait partie intégrante de la classification des objectifs en différentes catégories (comme nous l’expliquons plus bas).

Le changement de la longueur focale de l’objectif en fonction de la longueur d’onde, qui produit une dispersion axiale caractérisant l’aberration chromatique longitudinale, est également responsable de l’aberration chromatique latérale (voir la figure 5). Comme le grossissement est inversement proportionnel à la longueur focale, la variation de la longueur focale avec la longueur d’onde produit une dépendance correspondante du grossissement à l’égard de la longueur d’onde. Si cette aberration n’est pas corrigée dans l’objectif, les bords nets de l’image peuvent être entourés de franges de couleur rouge ou bleue. Dans les objectifs non corrigés, le grossissement de la composante bleue du signal peut varier d’environ 1 à 2 % par rapport à la composante rouge. Lorsqu’elle est présente dans un système optique à balayage confocal, l’aberration chromatique latérale peut entraîner une perte de signal au niveau du sténopé en raison de la possibilité que la lumière émise converge sur le plan d’image à un emplacement plus proche ou plus éloigné de l’axe optique que son emplacement réel sur l’échantillon, selon la composition spectrale de la lumière.

Les deux types d’aberrations chromatiques étant liés, les objectifs fortement corrigés pour l’aberration chromatique longitudinale présentent généralement une aberration chromatique latérale également minimisée. Différentes approches sont adoptées par les fabricants de microscopes pour corriger les différents facteurs affectant les performances optiques, et une association bien réfléchie des différents composants du système est essentielle pour obtenir une correction maximale des aberrations. En microscopie confocale de fluorescence, l’aberration chromatique latérale non corrigée entraîne des problèmes similaires à ceux du type longitudinal, car des erreurs sont introduites dans le mappage des emplacements des fluorophores émettant à différentes longueurs d’onde.

Dans l’histoire de la fabrication des microscopes optiques, on a suivi pendant très longtemps un principe pour la conception des objectifs selon lequel l’objectif devait former une image réelle à une distance fixe donnée de la surface de montage de l’objectif correspondant au plan focal avant de l’oculaire. Les configurations reposant sur la formation directe par l’objectif d’une image intermédiaire réelle sont appelées systèmes finis, et la distance jusqu’à l’image intermédiaire est appelée longueur du tube de l’objectif. Bien qu’à un moment donné, les différents fabricants aient standardisé leurs systèmes optiques finis avec la même longueur de tube et la même distance parfocale, différentes approches ont été employées pour compenser les aberrations des objectifs, et ce facteur doit être pris en compte si on souhaite combiner des composants optiques de différents fabricants. Les systèmes finis peuvent être conçus de façon à assurer une correction complète de l’aberration au niveau de l’objectif, ou un niveau résiduel connu d’aberration chromatique latérale peut être autorisé dans l’image formée par l’objectif, une compensation de cette aberration résiduelle étant alors effectuée par l’oculaire.

Dans le système optique corrigé à l’infini, les rayons lumineux qui quittent l’objectif ne sont pas focalisés, mais restent parallèles jusqu’à leur convergence au niveau du plan d’image intermédiaire réalisée au moyen d’une lentille de tube (parfois appelée lentille Telan). La plupart des grands fabricants de microscopes ont développé des systèmes optiques corrigés à l’infini, qui ont l’avantage intrinsèque que les rayons de lumière provenant de l’objectif et focalisés à l’infini sont relativement insensibles aux composants optiques supplémentaires placés dans « l’espace infini » entre l’objectif et la lentille de tube. Bien que la lentille de tube puisse effectuer une certaine correction des aberrations résiduelles, il existe des avantages dans la polyvalence des modèles qui assurent une correction complète dans l’objectif, la lentille de tube restant optiquement neutre. La figure 6 représente les trajets optiques à l’infini des microscopes à fluorescence droits et inversés typiques. La flèche blanche à double tête sur chaque schéma de microscope indique le trajet optique de chaque type de microscope entre l’ouverture arrière de l’objectif et la lentille de tube.

Différents fabricants adoptent différentes spécifications pour la conception de leurs systèmes corrigés à l’infini, notamment en ce qui concerne la longueur focale de la lentille de tube et la longueur de l’espace à l’infini. Les systèmes optiques à correction à l’infini permettent de déplacer l’objectif pour effectuer la mise au point au lieu de déplacer la platine du microscope, ce qui constitue un avantage certain dans les applications nécessitant une manipulation délicate de l’échantillon pendant l’observation. Cependant, le principal avantage pratique de l’espace infini réside dans le fait que des composants optiques auxiliaires, comme des analyseurs de lumière polarisée, des filtres et des prismes de contraste interférentiel différentiel (CID), peuvent être ajoutés sans avoir à se soucier de leurs propriétés de réfraction ou de leur épaisseur. Tant qu’ils ont des surfaces parallèles planes, ces éléments ajoutés ont un effet négligeable sur la qualité de l’image. En revanche, ces composants optiques ne peuvent pas être placés dans le trajet du faisceau d’un système corrigé à distance finie, qui converge entre l’objectif et le plan d’image intermédiaire, sans introduire de décalage de l’image et d’autres aberrations qui vont varier avec l’épaisseur et l’indice de réfraction des éléments ajoutés.

La correction optique dans les objectifs de microscope

Indépendamment de l’utilisation d’un système optique à correction finie ou à l’infini, les critères de performance des objectifs conçus pour le système doivent être pris en compte de façon combinée pour déterminer quels objectifs satisfont aux exigences d’une technique d’imagerie donnée. Les objectifs sont généralement regroupés en catégories de performances qui vont dépendre de leur degré de correction optique. Comme nous l’avons vu, l’importance relative des diverses aberrations et des critères de performance qu’elles affectent dépend de la manière dont l’objectif est utilisé et des besoins essentiels de l’application. La classification la plus générale des objectifs repose typiquement sur le degré de correction des aberrations chromatiques, la distinction entre les différentes catégories d’objectifs classiques ayant toutefois largement perdu en pertinence ces derniers temps en raison des avancées technologiques significatives dans la conception et la fabrication des composants optiques. Une grande partie de la nomenclature descriptive reste néanmoins valable et largement utilisée, et une compréhension des termes employés et du rapport qu’ils ont avec les applications confocales n’est pas inutile au moment de comparer les différents objectifs proposés.

Les aberrations chromatiques sont le résultat de la dispersion dans le verre optique utilisé pour fabriquer les lentilles, et elles sont généralement corrigées en utilisant une combinaison de lentilles ayant des propriétés de dispersion différentes. Traditionnellement, les objectifs ayant la plus faible correction des aberrations chromatiques sont classés comme objectifs achromatiques (voir la figure 7) et sont habituellement fabriqués avec du verre avec une dispersion « normale ». Les verres de ce type présentent une diminution presque linéaire de l’indice de réfraction à mesure que la longueur d’onde augmente et comprennent des verres crown et des verres flint. Le verre crown a généralement un faible indice de réfraction et une faible dispersion, contrairement au verre flint, qui a généralement un indice de réfraction élevé et une forte dispersion. Dans les objectifs achromatiques plus anciens, deux ou plusieurs lentilles constituées de ces types de verre étaient associées pour corriger l’aberration chromatique, de sorte que la lumière rouge et la lumière bleue soient focalisées de manière identique, et également une correction de l’aberration sphérique pour la lumière verte. Les objectifs achromatiques modernes ont généralement une correction supplémentaire de l’aberration sphérique et une correction importante de la courbure du champ. Si l’objectif est corrigé pour étendre la planéité du champ sur l’ensemble du champ de l’image, il reçoit la désignation d’objectif planachromatique. En général, les objectifs achromatiques sont adaptés à l’observation visuelle conventionnelle en fond clair, à la photomicrographie et à l’imagerie numérique avec une correction (de planéité) supplémentaire pour la courbure du champ.

Pour que l’objectif corrige davantage l’aberration chromatique, des types de verre ayant une dispersion anormale sur une partie du spectre sont nécessaires. Dans les verres qui présentent un changement non linéaire de l’indice de réfraction avec la longueur d’onde dans la région spectrale du rouge ou du bleu, les aberrations chromatiques peuvent être compensées pour permettre la focalisation simultanée de plus de deux longueurs d’onde. La fluorite cristalline fut l’un des premiers matériaux connus avec des propriétés optiques appropriées pour réduire le spectre secondaire non corrigé responsable des franges vertes ou violettes autour des bords nets, qui caractérisent les images observées avec des objectifs achromatiques. En combinaison avec divers verres optiques, les éléments en fluorite permettent de corriger les aberrations chromatiques de l’objectif pour trois longueurs d’onde (trois couleurs) et l’aberration sphérique pour deux longueurs d’onde. En outre, ces objectifs fortement corrigés ont amélioré les caractéristiques de transmission dans la région spectrale de l’ultraviolet.

Des évolutions technologiques plus récentes ont permis de mettre au point de nouvelles préparations de verre optique et des capacités de façonnage des lentilles qui produisent des propriétés de dispersion semblables à celles des éléments en fluorite, et la plupart des fabricants produisent une gamme d’objectifs fluor ayant des corrections optiques s’approchant de celles des objectifs de la catégorie la plus élevée (voir la figure 7). Ces objectifs sont parfois appelés semi-apochromatiques et peuvent contenir ou non des éléments en fluorite, mais en raison de leurs caractéristiques optiques, les différents fabricants les désignent sous des noms tels que Fl et PlanFl. Les objectifs actuels de cette catégorie sont disponibles dans de nombreuses configurations, avec notamment des modèles destinés à une utilisation avec plusieurs milieux d’immersion, et ils sont adaptés à une utilisation en fond clair, en fluorescence, en contraste de phase, en lumière polarisée et en contraste interférentiel différentiel, ainsi qu’à certaines applications confocales et multiphotoniques.

Les objectifs classés comme apochromatiques sont généralement ceux qui ont le plus haut niveau de correction des aberrations chromatiques et sphériques (voir la figure 7). Ces objectifs ont généralement les ouvertures numériques les plus grandes disponibles pour un grossissement donné, et les aberrations chromatiques et sphériques sont corrigées pour au moins trois longueurs d’onde. Avec une correction presque complète des aberrations, les objectifs apochromatiques conviennent généralement à toutes les techniques de microscopie, tous les critères de performance spécifiques à une technique donnée devant toutefois être pris en compte. Malgré leur degré exceptionnel de correction optique, les objectifs apochromatiques utilisent des triplets ou des doublets de lentilles et, de ce fait, sacrifient parfois d’autres caractéristiques techniques importantes, comme l’ouverture numérique ou la planéité. Les nouvelles techniques de fabrication commerciale ont permis de surmonter ce compromis grâce à une nouvelle technologie de polissage de lentille permettant d’utiliser des lentilles ultrafines. En combinant des lentilles convexes et concaves ultrafines, ces objectifs corrigent l’aberration chromatique et ont une meilleure transmittance dans la plage spectrale allant du violet au proche infrarouge, ont une ouverture numérique plus grande et une planéité accrue.

Les applications de fluorescence confocale peuvent être fortement limitées si les aberrations de l’objectif ne sont pas corrigées de la même façon pour les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, une condition rendue plus difficile à remplir lorsque l’on utilise plusieurs fluorophores ou lorsque la différence entre les longueurs d’onde d’excitation et d’émission est importante. Pour que l’énergie photonique détectée soit maximale, la parfocalité entre le point d’éclairage et la région détectée observée au niveau du sténopé doit être maintenue. De nombreux objectifs, même dans la catégorie des objectifs apochromatiques, ne permettent pas une correction adéquate pour les techniques de fluorescence combinant l’excitation dans l’ultraviolet et l’émission dans le spectre visible. Des composants optiques supplémentaires peuvent être utilisés au niveau de la source laser ultraviolette pour compenser l’incapacité de l’objectif à s’adapter à la large plage de longueurs d’onde, mais cela ajoute des dépenses et une complexité de fonctionnement considérables au système confocal.

Les objectifs à immersion dans l’eau et les objectifs à immersion dans l’huile de silicone à haute performance sont spécifiquement conçus pour répondre aux besoins imposés par les domaines de la recherche recourant à l’imagerie de cellules vivantes. L’un des principaux objectifs est d’obtenir des performances optimales en microscopie confocale de fluorescence pour les échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus vivants placés dans des milieux physiologiques. Il est indispensable de comprendre que, quel que soit le niveau de correction des aberrations intégré à la conception d’un objectif, des aberrations supplémentaires peuvent être introduites dans le trajet optique en dehors de l’objectif si on ne respecte pas les critères de fonctionnement de l’objectif, et ces aberrations peuvent dégrader les performances des meilleurs composants.

Des objectifs conçus pour l’immersion directe ou à trempage dans l’eau, comportant des nez spéciaux en céramique ou en polymères, sont proposés pour les études sur les cellules vivantes et les études physiologiques. Ces études nécessitent souvent un accès à l’échantillon pour réaliser des mesures ou d’autres manipulations et ne peuvent pas être effectuées avec une lamelle couvre-objet. En général, les objectifs à trempage dans l’eau sont du type fluorite, ont une forte transmission dans les régions spectrales de l’ultraviolet et de l’infrarouge et sont conçus avec de longues distances de travail et un profil étroit de la partie qui trempe dans l’eau au bas de l’objectif. Le nez angulaire de l’objectif plus petit que celui des autres objectifs est conçu pour permettre un accès maximal à l’échantillon pour la fixation de microélectrodes ou pour effectuer d’autres opérations au cours du travail d’observation. Les longues distances de travail, qui peuvent être de plusieurs millimètres avec certains objectifs de ce type, permettent également un meilleur accès à l’échantillon. La partie immergée de nombreux objectifs à trempage est fabriquée en céramique ou dans un autre matériau isolant inerte qui assure isolation électrique et résistance chimique. La combinaison de leurs différentes caractéristiques rend les objectifs à trempage dans l’eau bien adaptés aux méthodologies d’imagerie sur des échantillons vivants comme l’imagerie confocale, l’imagerie multiphotonique et de nombreuses autres méthodes.

En plus du grossissement, de l’ouverture numérique et du degré de correction optique, la distance de travail d’un objectif a une importance particulière en microscopie confocale et dans d’autres techniques de microscopie numérique utilisées pour l’acquisition d’informations tridimensionnelles sur des échantillons. La distance de travail, pour un objectif nécessitant une lamelle couvre-objet, est définie comme la distance entre la surface supérieure de la lamelle et la lentille avant, lorsque le microscope est mis au point sur un plan de l’échantillon en contact avec la lamelle (figure 9(b)). Cette distance est importante lorsque l’imagerie confocale est réalisée à différentes profondeurs dans l’échantillon, car elle détermine la profondeur de pénétration focale maximale réalisable avant que l’objectif ne touche le haut de la lamelle. La distance de travail limite donc la plage le long de l’axe Z à partir de laquelle les données d’un échantillon peuvent être collectées.

Par exemple, un objectif avec une distance de travail de 0,20 millimètre (200 microns) peut être mis au point à une profondeur maximale de 200 microns sous la lamelle couvre-objet avant que l’objectif ne touche la surface supérieure de la lamelle. Dans une certaine limite, la distance de travail peut être modifiée par la conception optique, mais elle diminue généralement à mesure que le grossissement, l’ouverture numérique et la correction optique augmentent. Maintenir une grande ouverture numérique et un haut degré de correction des aberrations avec une longue distance de travail est difficilement réalisable en raison des contraintes géométriques imposées par la forme des lentilles et du nombre de lentilles requis dans un objectif hautement corrigé. Les caractéristiques techniques de nombreux objectifs actuellement proposés représentent des progrès remarquables en matière de performances, ces progrès étant rendus possibles par des améliorations apportées aux verres optiques, aux revêtements de lentille et aux capacités de conception assistée par ordinateur.

Le fait que l’intensité du signal soit proportionnelle au carré de l’ouverture numérique a des implications dans le choix des objectifs optimaux pour la microscopie confocale, qui dans certains cas ont une incidence sur l’importance relative de divers facteurs de performance. Lors de l’utilisation de systèmes à balayage confocal dotés d’une fonction de zoom électronique, il est rarement nécessaire d’utiliser un grossissement optique de 100X, une grande ouverture numérique et des objectifs 40X et 60X hautement corrigés pouvant s’avérer plus appropriés. Ils peuvent acquérir des images à champ de vision large au moyen de la fonction « Scan zoom » à plus faible grossissement et des images de structures subcellulaires en haute résolution à plus fort grossissement.

De nombreuses techniques très prisées, telles que l’imagerie d’immunofluorescence, souffrent intrinsèquement de niveaux de luminosité tellement faibles que les propriétés de transmission du système optique sont d’une importance cruciale. Seuls quelques photons peuvent être disponibles pour détecter des détails infimes de l’échantillon et, par conséquent, une différence relativement mineure de pourcentage de transmission à la longueur d’onde d’excitation ou d’émission du fluorophore peut s’avérer critique pour déterminer la détectabilité d’un élément marqué de l’échantillon. Dans certaines situations, les propriétés de transmission de l’objectif peuvent avoir une plus grande importance que d’autres caractéristiques techniques telles que la planéité du champ et la correction des aberrations, qui nécessitent des lentilles et des revêtements supplémentaires susceptibles d’augmenter la perte de lumière dans une plage de longueurs d’onde critique. Cependant, les progrès de la technologie optique évitent ce compromis en matière de transmittance grâce à des technologies de fabrication de lentilles particulières.

Le nombre de techniques spécialisées appliquées aux problèmes de biologie cellulaire et moléculaire, ainsi qu’à ceux d’autres domaines, a entraîné des changements dans les exigences imposées aux systèmes d’imagerie optique, notamment en ce qui concerne l’objectif du microscope. L’augmentation spectaculaire du recours aux techniques de balayage confocal dans les études tridimensionnelles d’échantillons biologiques a eu une influence majeure sur les produits développés pour le commerce, même si des méthodes telles que le piégeage par laser, l’excitation multiphotonique, le transfert d’énergie entre molécules fluorescentes (FRET), l’hybridation in situ fluorescente (FISH) et le contraste interférentiel différentiel infrarouge ont également introduit de nouveaux besoins. Un certain nombre de paramètres s’appliquant à des techniques spécialisées ont fait apparaître que certains critères de performance traditionnels des objectifs pouvaient être sacrifiés au moins partiellement afin d’améliorer d’autres critères plus importants. Des progrès spectaculaires dans la conception de lentille assistée par ordinateur et la formulation des verres optiques, en plus de ceux des technologies de revêtement antireflet, ont abouti à l’introduction d’objectifs améliorés capables de satisfaire à de nombreux nouveaux besoins, avec peu de compromis, voire aucun, en microscopie conventionnelle à champ large. Parmi ces objectifs, on peut citer les objectifs à immersion dans l’huile de silicone à haute performance avec une ouverture numérique plus grande, une distance de travail accrue et des bagues de correction des aberrations sphériques ou encore les objectifs avec une transmission UV et infrarouge améliorée. En outre, les objectifs fabriqués avec des lentilles ultrafines permettent aux chercheurs d’obtenir une grande ouverture numérique, une forte transmittance, une correction des aberrations chromatiques sur une plage spectrale plus large et une planéité accrue sans compromis sur aucune de ces caractéristiques techniques.

De nombreux objectifs modernes sont adaptés à la microscopie confocale lorsqu’ils sont utilisés conformément à ce pour quoi ils ont été conçus. L’examen en haute résolution et l’imagerie tridimensionnelle précise d’échantillons aqueux épais avec un microscope confocal à balayage laser sont des applications particulièrement exigeantes qui nécessitent un objectif satisfaisant à tous les critères suivants : une grande ouverture numérique pour capter efficacement la fluorescence, une longue distance de travail permettant une profondeur de pénétration maximale, un champ plat pour une reconstruction tridimensionnelle fidèle, une faible aberration chromatique axiale pour la parfocalité de plusieurs fluorophores et une faible aberration chromatique latérale pour permettre une prise précise de plusieurs images de fluorescence, en plus d’une forte transmittance aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission.