Le contraste par modulation d’Hoffman, également connu sous le nom de « contraste en relief », est une technique de microscopie optique conçue pour augmenter le contraste des échantillons vivants et non colorés contenus dans un récipient en plastique. Cette technique est basée sur la détection des gradients optiques et leur conversion en différences d’intensités lumineuses.

Cet article traite en détail du contraste par modulation d’Hoffman, de la configuration de base du microscope à ses avantages et ses limites.

Figure 1 Configuration de base du microscope pour le contraste par modulation d’Hoffman

Configuration de base du microscope pour le contraste par modulation d’Hoffman

La figure 1 représente la configuration de base du microscope pour le contraste par modulation d’Hoffman. Un filtre spatial (optique) en amplitude, appelé « modulateur » par Hoffman, est inséré dans le plan focal arrière d’un objectif. L’intensité lumineuse qui traverse ce système varie au-dessus et en dessous d’une valeur moyenne qui est ensuite modulée. Les objectifs utilisés pour le contraste par modulation peuvent couvrir toute la plage de grossissements de x10, x20 et x40.

Le modulateur possède trois zones (représentées dans la figure 2) :

• Une petite zone sombre proche de la partie périphérique du plan focal arrière qui laisse passer uniquement 1 % de la lumière (zones indiquées par D dans la figure 2)
• Une zone grise étroite qui laisse passer 15 % de la lumière (zones indiquées par G dans la figure 2)
• La zone restante, claire ou transparente, couvrant la plus grande partie à l’arrière de l’objectif, laisse passer 100 % de la lumière (zones indiquées par B dans la figure 2)

Contrairement à la lame de phase dans la microscopie à contraste de phase, le modulateur d’Hoffman est conçu pour ne pas altérer la phase de la lumière qui traverse ces zones. Lorsqu’ils sont observés à travers des optiques prévues pour le contraste par modulation, les objets transparents qui sont en général invisibles en microscopie en fond clair ordinaire prennent une apparence tridimensionnelle (3D) du fait des gradients de phases.

Dans le système d’Hoffman, les fentes se trouvent dans le plan focal avant du condenseur, comme illustré dans la figure 1. Lorsque la lumière traverse la fente désaxée, son image se forme dans le plan focal arrière de l’objectif (également appelé le plan de Fourier) dans lequel le modulateur est monté. Le plan focal avant du condenseur contenant la plaque avec la fente désaxée est optiquement conjugué au modulateur du plan focal arrière de l’objectif. L’intensité de l’image est proportionnelle à la première dérivée de la densité optique dans l’échantillon et contrôlée par l’ordre zéro du modèle de diffraction du gradient de phase.

Des gradients opposés entraînent la déviation de l’image de la fente soit vers la partie très sombre soit vers la partie claire du modulateur. Prenons l’exemple suivant : un échantillon hypothétique, contenant à la fois des gradients de phase positif et négatif (épaisseur) et une zone plane (sans gradient), est observé à l’aide des composants optiques pour le contraste par modulation. Le gradient positif dévie la lumière dans la zone claire du modulateur, dans laquelle il n’y a aucune atténuation et 100 % de cette lumière traverse le plan d’image intermédiaire. De même, la lumière déviée par un gradient négatif dans la zone sombre du modulateur est atténuée à une valeur d’environ 1 % de sa valeur précédente.

Toutes les parties de l’échantillon sans gradient, ainsi que l’arrière-plan, se décalent dans la partie grise du modulateur, où environ 15 % de la lumière traverse le plan d’image intermédiaire. Le résultat est que l’intensité de la zone de l’image d’un côté du gradient est sombre. L’intensité du côté opposé du gradient produit une zone d’image claire et la zone sans gradient apparaît en gris dans l’image, tout comme l’arrière-plan.

Les quatre principaux avantages du contraste par modulation d’Hoffman

Le contraste par modulation d’Hoffman offre de nombreux avantages, mais aussi quelques limites. Parmi les avantages du contraste par modulation d’Hoffman, on compte les suivants :

1. Une meilleure utilisation de l’ouverture numérique de l’objectif

La capacité à utiliser des ouvertures numériques plus grandes avec le contraste par modulation d’Hoffman produit une excellente résolution pour visualiser les détails ainsi qu’une bonne visibilité et un bon contraste au niveau de l’échantillon.

2. La compatibilité avec les récipients en plastique

Le contraste par modulation d’Hoffman peut être utilisé avec succès avec des matériaux biréfringents, comme des boîtes en plastique, sans distorsion d’image. La biréfringence, ou double réfraction, est le phénomène qui se produit dans certains matériaux lorsqu’un rayon incident (rayon lumineux qui frappe une surface) est divisé en deux rayons lorsqu’il traverse ledit matériau.

Le contraste par modulation d’Hoffman est une bonne alternative aux méthodes de contraste qui ne donnent pas de bons résultats avec des matériaux biréfringents. Par exemple, l’examen de matériaux biréfringents avec un contraste interférentiel différentiel (CID) peut engendrer des artéfacts, une perte de contraste ainsi que d’autres problèmes de qualité d’image.

Par conséquent, le contraste par modulation d’Hoffman est une méthode idéale pour observer et prendre des images de cellules, de tissus et de cultures d’organes dans des récipients en plastique.

3. La possibilité de recourir au sectionnement optique

Cette technique permet également de réaliser des coupes optiques. Le sectionnement optique permet de faire la mise au point sur un plan fin unique de l’échantillon, sans interférence gênante venant d’images issues de zones situées au-dessus ou en dessous du plan focal.

La profondeur d’un échantillon est mesurée dans une direction parallèle à l’axe optique du microscope. La mise au point règle la bonne distance entre l’échantillon et l’image, ce qui permet aux interférences des ondes diffractées de se produire dans un plan prédéterminé (le plan de l’image) positionné à une distance fixe de l’oculaire. Cela permet aux objets diffractés présents à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon d’être observés séparément, à condition que le contraste soit suffisant.

La profondeur totale d’un échantillon peut être sectionnée optiquement en faisant une mise au point séquentielle sur chaque plan successif. Dans ce système, la profondeur de champ est la distance entre un niveau et le niveau suivant dans lequel une imagerie de détails distincts est obtenue ; la profondeur de champ est déterminée par l’ouverture numérique de l’objectif. Les objectifs avec une grande ouverture numérique ont des profondeurs de champs très faibles. L’inverse se vérifie pour les objectifs ayant une petite ouverture numérique. La capacité générale d’un objectif à isoler et à faire la mise au point sur une coupe optique spécifique diminue à mesure que l’homogénéité optique de l’échantillon diminue.

4. Une meilleure visibilité

Un autre avantage du contraste par modulation d’Hoffman est la meilleure visibilité. Les images apparaissent ombrées ou en pseudo-3D, ce qui améliore la visibilité grâce aux différences de contraste de chaque côté d’un détail. Par ailleurs, ces images ne présentent aucun halo, contrairement aux images produites par les optiques à contraste de phase. Le contraste par modulation d’Hoffman convertit les informations des gradients de phases en différences d’amplitudes qui sont très différentes des variations de la relation de phases (et des différences de chemins optiques) produites par un microscope à contraste de phase.

L’utilisation des zones sombres et grises dans le modulateur produit des images qui contiennent différents tons de gris et qui sont dépourvues de couleurs. Il est possible d’introduire de la couleur dans les images de contraste par modulation en utilisant des modulateurs dont les zones sombres et grises sont remplacées par des zones colorées avec les mêmes valeurs de transmittance. Dans ce cas, les images résultant du gradient de phase seraient colorées avec des gradients similaires dans la même teinte. À ce jour, nous n’avons pas connaissance de l’existence de filtres de modulation dotés de zones colorées commercialement disponibles.

Limites du contraste par modulation d’Hoffman

Le contraste par modulation d’Hoffman souffre également de nombreux inconvénients et limites. Tout d’abord, ces images doivent être interprétées avec précaution. La raison en est que différents observateurs peuvent prendre une « bosse » dans l’image pour un « creux » ou inversement étant donné que l’image en pseudo-3D est observée à travers un oculaire. Le système est également très sensible aux gradients perpendiculaires à la longueur de la fente. Par conséquent, cette technique exige un certain niveau de compétence pour bien positionner l’échantillon et obtenir le meilleur effet.

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