La microscopie en fond noir est une technique qui tire parti de l’éclairage oblique pour améliorer le contraste au niveau des échantillons dont la qualité des images obtenues est insuffisante dans des conditions d’éclairage normales.

Une fois la lumière directe bloquée par un diaphragme opaque dans le condenseur, la lumière traversant l’échantillon selon des angles obliques est diffractée, réfractée et réfléchie dans l’objectif du microscope pour former une image claire de l’échantillon superposée sur un fond noir.

Ce fond noir offre un haut degré de contraste et permet de faire ressortir les échantillons sur fond complexe à moindre effort ou presque. Les images ci-dessous en montrent des exemples.

À droite : stigmates et trachée d’une larve de ver à soie. De minuscules fragments de bois apparaissent incroyablement beaux lorsqu’ils sont éclairés en fond noir à l’aide d’un microscope à lumière transmise.

À gauche : papillon. En raison du large spectre de motifs présents sur les ailes des membres de cet ordre, les papillons comptent parmi les sujets les plus colorés du monde des insectes. L’image numérique révèle les nombreuses écailles miniatures qui ornent la majeure partie de la surface d’une aile de papillon. Les écailles des ailes ont été éclairées en fond noir à l’aide d’un condenseur situé sous la platine et capturées à un faible grossissement (50x).

Comment fonctionne la microscopie en fond noir ?

L’éclairage en fond noir nécessite de bloquer la majeure partie de la lumière qui passe généralement à travers et autour de l’échantillon, afin que seuls les rayons obliques puissent interagir avec lui.

La lentille supérieure d’un simple condenseur à fond noir Abbe est sphérique et concave, ce qui permet aux rayons lumineux qui émergent de sa surface de former un cône de lumière creux inversé focalisé sur le plan de l’échantillon. Dans les zones en dehors de l’échantillon et lorsque l’ouverture numérique du condenseur est supérieure à celle de l’objectif, les rayons obliques se croisent et ratent l’objectif, ce qui fait que ces zones apparaissent sombres sur l’image.

Lorsqu’un échantillon (en particulier un échantillon non coloré et qui n’absorbe pas la lumière) est placé sur une lame, les rayons obliques interagissent avec lui et sont diffractés, réfléchis et/ou réfractés par certains des éléments qu’il contient, tels que les membranes, les noyaux et les organites internes des cellules. Ces faibles rayons peuvent ainsi pénétrer dans l’objectif. Le résultat est un échantillon brillant sur fond noir.

Quels sont les composants nécessaires pour la microscopie en fond noir ?

La plupart des microscopes de laboratoire à fond clair peuvent être facilement adaptés de manière à fournir un éclairage en fond noir. La façon la plus simple de procéder est de remplacer votre condenseur par un condenseur adapté à un éclairage en fond noir (figure 1).

Ces condenseurs sont relativement simples et offrent l’ouverture numérique (NA) élevée requise pour créer le cône d’éclairage nécessaire au fond noir. Cependant, changer de condenseur à chaque fois que l’on a besoin de changer de méthode d’éclairage reste peu pratique au quotidien. Heureusement, il existe une solution pour contourner ce problème.

De nombreux condenseurs peuvent intégrer des inserts à même de créer un cône d’éclairage. Ces inserts n’offrant pas une ouverture numérique aussi élevée qu’un condenseur à fond noir dédié, tous les objectifs ne peuvent pas être utilisés. Les inserts vous permettent quand même de disposer de plusieurs méthodes d’observation avec le même condenseur.

Figure 1. Condenseur conçu spécialement pour l’éclairage en fond noir

Pourquoi la microscopie à fond noir est-elle une technique d’imagerie efficace ?

En règle générale, les objets dont les images sont prises dans des conditions appropriées d’éclairage en fond noir sont spectaculaires à observer. Souvent, les échantillons présentant un très faible contraste inhérent à la microscopie en fond clair rayonnent sur fond noir.

L’éclairage en fond noir est idéal pour révéler les contours, les arêtes, les limites et les gradients d’indice de réfraction. L’éclairage en fond noir convient particulièrement à l’observation de minuscules organismes aquatiques vivants, de diatomées, de petits insectes, d’os, de fibres, de cheveux, de bactéries non colorées, de levures, de cellules en culture tissulaire et de protozoaires.

Les spécimens non biologiques comprennent les cristaux minéraux et chimiques, les particules colloïdales, les échantillons destinés au comptage des poussières et les fines sections de polymères et de céramiques contenant de petites inclusions, des différences de porosité ou des gradients d’indice de réfraction.

Voici des exemples d’échantillons capturés à l’aide de l’imagerie en fond noir :

À gauche : cette photomicrographie spectaculaire en fond noir de la diatomée Arachnoidiscus ehrenbergi a été prise à l’aide d’un microscope Olympus par Mortimer Abramowitz. L’échantillon a été éclairé par un condenseur à fond noir à grande ouverture numérique, de l’huile d’immersion étant placée entre la lame de microscope et les lentilles avant de l’objectif et du condenseur. Au milieu : bois de tilleul. Les échantillons colorés rendent souvent très bien en microscopie en fond noir, qui en produit de magnifiques images en couleur sur un fond noir. Cette photomicrographie représente une mince coupe colorée d’une branche de tilleul observée sous éclairage en fond noir. À droite : ADN cristallin liquide. Cet ADN en solution très concentrée a subi une série de transitions en phase cristalline liquide pour former une phase hexagonale dense. Cette photomicrographie a été prise à l’aide d’un microscope optique équipé d’un objectif 10x sous un éclairage en fond noir.

Malheureusement, l’éclairage en fond noir est moins utile pour révéler les détails internes. D’autres facteurs doivent également être pris en compte si vous souhaitez tirer le meilleur parti de l’éclairage en fond noir.

Quels sont les inconvénients liés à l’utilisation de la microscopie en fond noir ?

Les échantillons destinés à être examinés au microscope à fond noir doivent être préparés avec soin, car les éléments situés au-dessus et en dessous du plan focal peuvent disperser la lumière et contribuer à altérer l’image. Si, d’une manière générale, la propreté de la lame est un facteur important pour la qualité de l’imagerie, elle l’est encore plus en fond noir, car chaque débris est éclairé et peut interférer avec l’objet que vous essayez d’observer.

Voici d’autres inconvénients liés à la configuration d’un microscope pour l’éclairage en fond noir :

• Éclairage insuffisant pour pouvoir voir l’échantillon, ou l’échantillon est visible, mais très pâle.

  La microscopie en fond noir nécessite une grande quantité de lumière pour obtenir une image correcte, car une grande partie de cette lumière est bloquée pour former le cône. N’hésitez donc pas à augmenter l’intensité de l’éclairage. Gardez cependant à l’esprit que certains échantillons peuvent ne pas apprécier d’être exposés à une telle lumière pendant de longues périodes.

• La lame présente une tache sombre au centre du champ de vision, tandis que les objets situés en périphérie sont bien illuminés et paraissent normaux.

  Ce problème survient généralement lorsque l’alignement ou la focalisation du condenseur est incorrecte. Le centrage et la focalisation appropriés du condenseur permettent de le résoudre. Cette solution s’applique à la plupart des situations dans lesquelles l’éclairage semble inégal alors que l’échantillon est net.

• Des couleurs apparaissent au niveau du fond, ou le fond est éclairé de manière inégale et présente une teinte grise.

  Ce problème survient généralement lorsque l’échantillon est trop épais ou monté sur un support contaminé. Un nouveau montage de l’échantillon peut permettre de le résoudre.

Quels sont les avantages de l’utilisation de la microscopie en fond noir ?

La microscopie en fond noir présente de nombreux avantages. Son fond noir offre un degré de contraste élevé permettant d’observer facilement des échantillons sur des fonds complexes. Cette technique est facilement accessible dans la mesure où de nombreux microscopes de laboratoire à fond clair peuvent être configurés pour réaliser un éclairage en fond noir. Outre les avantages pour la microscopie, cette technique permet de produire de véritables œuvres d’art avec l’échantillon magnifiquement éclairé sur un fond noir.

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