L’Hospital Nacional de Parapléjicos (HNP) de Tolède, en Espagne, est un centre national espagnol de référence en matière de lésions médullaires. Les objectifs de l’HNP sont de fournir des services complets de santé et de rééducation aux personnes atteintes de lésions médullaires, de former du personnel qualifié et d’effectuer des recherches scientifiques dans le domaine des neurosciences.
Pour appuyer la recherche en neurosciences, le HNP dispose de services centraux de microscopie et d’analyse d’images, de cytométrie en flux, de protéomique, de résonance magnétique nucléaire (RMN) pour les petits animaux, et d’une animalerie. Son service de microscopie et d’analyse d’images comprend une puissante solution multimodale permettant la numérisation de lames entières et le criblage à haut contenu (HCS) avec un seul microscope.
Cette solution combine le système de microscope automatisé IXplore™ Pro avec le logiciel de criblage à haut contenu ScanR* et le logiciel d’imagerie cellSens™. Elle peut s’adapter à une grande variété d’applications et de techniques d’imagerie, y compris l’analyse d’images avancée à l’aide de la technologie d’apprentissage profond TruAI™.
Figure 1. Vue panoramique de l’Hospital Nacional de Parapléjicos de Tolède, en Espagne.
Photo reproduite avec l’aimable autorisation de Juan Carlos Monroy.
Le service de microscopie et d’analyse d’images de l’Hospital Nacional de Parapléjicos est géré par le Dr José Ángel Rodríguez Alfaro et le Dr Javier Mazarío. Nous les avons interrogés récemment pour en savoir plus sur ce qu’ils pensent de l’utilisation du système IXplore Pro en association avec les logiciels scanR et cellSens dans les services centraux de leur établissement.
Q. : Pourquoi avoir envisagé d’acquérir un système de microscope IXplore avec le logiciel scanR pour votre service ?
R. : Dans notre service, nous avons un large éventail de microscopes optiques allant des microscopes confocaux à balayage laser automatisés aux microscopes manuels classiques. Auparavant, nous avions un système d’analyse à haut contenu (HCA) à enceinte fermée qui est tombé en panne après 10 ans d’utilisation ; il nous fallait donc un système de remplacement.
Lorsque cela s’est produit, nous recherchions des moyens d’exporter les données obtenues avec ce système vers un logiciel d’analyse de cytométrie de flux pour pouvoir effectuer une analyse plus fine des mesures obtenues avec notre système HCA.
Concernant le système scanR, la première chose qui a retenu notre attention, c’est que ce genre d’analyse cytométrique fenêtrée était déjà intégré au logiciel. Nous n’avons trouvé aucun autre système HCA capable d’effectuer ce type d’analyse. C’est l’un des facteurs clés qui nous a fait nous pencher pour un système IXplore avec le logiciel scanR.
Q. : Quelles autres fonctionnalités du système avez-vous aimées ?
R. : Nous avons aimé le fait que ce n’était pas un système fermé, et le fait qu’avec le logiciel cellSens, nous aurions aussi un microscope à champ large capable de numériser des lames. Cette configuration deux en un du système s’est avérée parfaite pour nous, car elle nous a permis d’augmenter la variété de nos services.
La modularité du système est très pratique. Grâce à elle, nous sommes en mesure d’ajouter des fonctionnalités supplémentaires quand nous en avons besoin, comme l’intégration d’un incubateur pour étudier les cellules vivantes.
Un autre point important a été la possibilité d’intégrer dans notre offre de services une technologie d’analyse d’images de pointe reposant sur l’intelligence artificielle comme la technologie TruAI, qui fonctionne non seulement avec les images de cellSens et scanR, mais aussi avec les images acquises sur d’autres systèmes de microscope.
Q. : Quel a été l’impact sur votre service de l’ajout d’un système IXplore ? Qu’est-ce qui a changé ?
R. : Le système IXplore associé au logiciel scanR est rapidement devenu le microscope le plus utilisé au niveau de notre service. Son temps d’utilisation est deux fois plus important que celui des microscopes confocaux, les précédentes « vedettes » du service.
Même si ce n’est qu’un microscope à épifluorescence, la résolution des images est suffisamment bonne pour que les chercheurs envisagent de se passer de l’imagerie confocale pour certaines de leurs études, surtout lorsque la rapidité compte plus que la résolution Z. Cela leur permet maintenant d’acquérir des images qui étaient tout simplement trop longues à acquérir au moyen de nos microscopes confocaux à balayage laser.
Et nous ne parlons pas seulement d’une augmentation de la vitesse, mais aussi de la possibilité d’utiliser le portoir de quatre lames en combinaison avec la carte de mise au point pour configurer des expériences avec une acquisition des images sans surveillance pendant la nuit.
La possibilité d’exécuter une analyse des données à la volée lors de leur acquisition avec le logiciel scanR est une autre amélioration importante par rapport à notre précédent système HCA. Dès que l’acquisition d’images est terminée, nous obtenons les résultats de l’analyse et pouvons passer à l’échantillon suivant.
La technologie d’apprentissage profond TruAI s’est également avérée un outil très utile. La détection des noyaux dans les échantillons de culture cellulaire à haute densité s’est considérablement améliorée par rapport aux techniques de segmentation standard, ce qui permet aux utilisateurs de tirer des données plus précises de leurs expériences.
Q. : Pouvez-vous fournir un exemple de l’utilisation du système IXplore avec le logiciel cellSens dans votre service ? Qu’est-ce que les chercheurs cherchent à observer dans les images ?
R. : Très souvent, nous faisons l’acquisition d’images en haute résolution de coupes transversales ou horizontales de la moelle épinière de souris, de rats, voire de porcs, dans lesquelles les chercheurs recherchent des changements au niveau des populations de cellules gliales, de la survie des neurones ou de l’expression de différents marqueurs après une lésion médullaire. Ils recherchent également les axones qui se développent au niveau de la lésion.
Mais nous ne nous limitons pas au tissu de moelle épinière. Nous réalisons également des acquisitions en haute résolution sur des coupes du cerveau. Dans cet exemple, nous avons fait l’acquisition d’une coupe complète d’un cerveau de souris au moyen du contraste interférentiel différentiel (CID) pour rechercher l’emplacement de l’expression du gène rapporteur fluorescent mCherry.
Figure 2. Image de lame entière d’un cerveau de souris acquise en CID et en fluorescence.
Image reproduite avec l’aimable autorisation du groupe expérimental de neurophysiologie et des réseaux neuronaux de l’HNP. 14
Figure 3. Gros plan d’une région de l’image précédente.
Image reproduite avec l’aimable autorisation du groupe expérimental de neurophysiologie et des réseaux neuronaux de l’HNP. 18
Q. : Pouvez-vous fournir un exemple de l’utilisation du logiciel scanR pour l’HCA dans votre centre ? Qu’est-ce que les chercheurs cherchent à observer dans les données ?
R. : L’analyse HCA est très souvent utilisée dans des études sur la prolifération, la différenciation et la migration des cellules dans différentes conditions. Dans notre service, la détection de l’expression de gènes rapporteurs (GFP et mCherry) lors de différents traitements est l’une des expériences les plus fréquentes que nous effectuons avec le logiciel scanR. Nous combinons l’utilisation de la technologie TruAI pour la segmentation des noyaux dans les cultures cellulaires à haute densité avec l’analyse fenêtrée pour quantifier le nombre de cellules à marquage simple et doublement marquées dans la population et pour évaluer l’effet des différents traitements.
Nous avons également utilisé le système pour la détection de l’hybridation in situ de sondes fluorescentes (FISH) dans des échantillons de sang et de sperme. Dans ce cas, nous utilisons non seulement la technologie TruAI pour la segmentation des noyaux, mais aussi pour la détection des points de FISH dans les noyaux.
Figure 4. Fenêtre principale du logiciel scanR montrant la segmentation des cellules et des noyaux entourée de diagrammes de dispersion et d’histogrammes. Dans les diagrammes de dispersion bidimensionnels, chaque point représente une cellule segmentée. Dans les histogrammes unidimensionnels, chaque ligne représente la valeur d’un paramètre, la hauteur d’une ligne représentant le nombre de cellules ayant cette valeur. Dans le premier diagramme de dispersion, une fenêtre (R01) sélectionne une sous-population de cellules en fonction de leur taille et de leur forme, et cette population est transférée vers les graphiques d’analyse suivants. Les cellules en dehors de R01 sont éliminées. Dans les deuxième et troisième graphiques d’analyse, des fenêtres de cellules vertes positives (R02) et de cellules rouges positives (R03) sont créées. Dans le graphique d’analyse final, les fenêtres R01, R02 et R03 sont combinées pour obtenir le pourcentage de cellules positives pour un ou deux marqueurs. Données reproduites avec l’aimable autorisation du groupe de neurologie moléculaire de l’HNP.
Figure 5. Le logiciel scanR vous permet de créer des galeries à partir de régions fenêtrées. Les exemples montrent des galeries pour les populations de cellules suivantes : double négative, simple positive verte, simple positive rouge et double positive rouge et verte. Les résultats peuvent être exportés sous forme de tableaux ou visualisés sous forme de carte de densité dans le contexte d’une plaque de puits.
Données reproduites avec l’aimable autorisation du groupe de neurologie moléculaire de l’HNP.
Q. : Utilisez-vous la technologie TruAI pour développer vos propres modèles de réseau neuronal d’apprentissage profond ?
R. : Oui. Nous avons entraîné des modèles pour la segmentation des noyaux de cellules agrégées très densément, la détection des neurones dans les coupes de moelle épinière, la classification de différents types de fibres musculaires, la reconnaissance des noyaux anormaux après certains traitements, etc.
C’est l’un des aspects du logiciel que nous apprécions le plus, cette possibilité d’entraîner facilement des modèles de réseau neuronal, non seulement à partir d’images acquises avec ce système, mais aussi à partir d’images prises avec des microscopes d’autres marques qu’Olympus. Et le fait que nous puissions désormais utiliser OlyVIA, une application de visualisation gratuite, pour annoter les images rend le logiciel encore plus pratique, puisque les utilisateurs peuvent le faire sur leurs propres ordinateurs, au bureau ou à la maison.
Figure 6. L’image de gauche montre le marqueur neuronal NeuN (vert) d’une coupe de la moelle épinière d’une souris.
L’image de droite représente la même coupe avec un calque montrant la détection par la technologie TruAI des cellules NeuN positives (rose).
Images reproduites avec l’aimable autorisation du groupe de neuroprotection moléculaire de l’HNP.
Q. : Qu’est-ce que vous aimez le plus dans le système ?
R. : Comme nous l’avons déjà indiqué, il y a beaucoup d’aspects de ce système que nous apprécions beaucoup. Mais peut-être que le plus remarquable de tous, c’est qu’avec la combinaison du logiciel cellSens et du logiciel scanR, nous pouvons passer de la numérisation de lames entières à l’HCA avec un seul système de microscope. Cette configuration deux en un est parfaitement adaptée à l’optimisation des ressources de notre service. Et, bien sûr, il y a la technologie TruAI, qui est entièrement compatible avec les deux systèmes. Elle nous permet d’utiliser les modèles de réseau neuronal dans les deux logiciels, quel que soit le logiciel utilisé pour l’entraînement.
En savoir plus sur les systèmes de microscope IXplore
La série de microscopes IXplore est une gamme de microscopes inversés conçus pour différentes applications de recherche en sciences de la vie. Les microscopes inversés motorisés IXplore Pro comprennent des fonctions de fond clair, de fluorescence multicanal, d’empilement de mises au point et d’assemblage d’images.
Le système IXplore est contrôlé par le logiciel cellSens, la plateforme pour les microscopes Olympus équipés de caméra qui peuvent s’adapter à une grande variété d’applications et de techniques d’imagerie microscopique à champ large. Parmi elles, la microscopie classique, la microscopie confocale à disque rotatif, la super-résolution, la microscopie de fluorescence en réflexion totale interne (TIRF), la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et plus encore.
Avec le matériel sélectionné, le même microscope IXplore peut également être contrôlé avec le logiciel scanR, qui est spécialement conçu et optimisé pour les applications de criblage à haut contenu dans des plaques multipuits et des lames à chambres.
Personnes interviewées
Merci au Dr José Ángel Rodríguez Alfaro et au Dr Javier Mazarío, responsables du service de microscopie et d’analyse d’images de l’Hospital Nacional de Parapléjicos, en Espagne, pour nous avoir accordé cet entretien et fait part de leurs expériences. Pour toute question concernant le service, envoyez-leur un courriel à l’adresse microscopia.hnp@sescam.jccm.es.
Dr José Ángel Rodríguez Alfaro et Dr Javier Mazarío, responsable du service de microscopie
et d’analyse d’images du Hospital Nacional de Parapléjicos, en Espagne.
* Le système scanR n’est pas disponible au Japon.
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