Les systèmes de microscopie modernes sont capables d’observer des structures complexes avec une grande précision, ce qui en fait des systèmes indispensables pour les chercheurs en sciences de la vie qui étudient les mécanismes biologiques. Cependant, comme pour tous les équipements de laboratoire utilisés en recherche, votre microscope doit toujours fonctionner avec le même niveau de performance pour pouvoir produire des données reproductibles.
Cela représente un défi, car les équipements de microscopie et les analyses d’images ne cessent de gagner en complexité.
Dans cet article, nous examinons de plus près l’importance du contrôle des performances des microscopes, et nous vous expliquons de quelle manière les outils analytiques peuvent vous aider à identifier les problèmes qui introduisent des biais dans vos résultats.
Comment des biais peuvent s’introduire dans vos données expérimentales
Des biais peuvent facilement se glisser dans votre expérience à partir de différentes sources. Prenons l’analyse morphologique par exemple. Si vous souhaitez mesurer les changements de structure cellulaire, il vous faut réaliser des prises de vue et mesurer les différences morphologiques. Même si votre microscope fonctionne de façon optimale, des biais dans les images, et par conséquent dans les résultats, peuvent survenir en raison de la façon dont les échantillons ont été préparés ou encore de variations biologiques dans l’échantillon. Cela pose un défi pour l’acquisition de données précises et reproductibles.
Imaginez maintenant que cette tâche ait été effectuée au moyen d’un microscope non étalonné. D’autres biais causés directement par le microscope vont être introduits dans l’image, et les mesures qui en découlent vont présenter des erreurs et des imprécisions. Par conséquent, il vous sera difficile de reproduire le même ensemble de données si vous répétez la même expérience.
C’est un problème de taille pour les chercheurs qui entendent publier leurs données expérimentales. Imaginons qu’un réviseur vous demande de répéter une expérience. Sans instruments correctement étalonnés, vous pourriez avoir bien des difficultés à obtenir des résultats comparables.
Bien qu’on ne puisse pas faire grand-chose pour limiter les variations biologiques présentes dans un échantillon, il existe en revanche des moyens de vérifier les performances du microscope et de découvrir à quel endroit un biais s’est introduit dans vos images et vos mesures. Nous évoquerons les moyens à votre disposition plus loin dans cet article, mais examinons avant cela les erreurs et les biais qui affectent les mesures.
Erreurs dans les mesures
Un grand nombre d’analyses quantitatives différentes peut être effectué au moyen d’un microscope. La plupart des applications quantitatives incluent la mesure et la comparaison de l’intensité de la fluorescence ou des changements spatiaux présents dans une image.
Chaque mesure va comporter une certaine quantité d’erreurs ou de biais. Cette erreur peut être introduite par l’échantillon ou le microscope, et elle peut se manifester par une inexactitude ou une imprécision dans les mesures. Bien que l’inexactitude donne des mesures uniformément incorrectes, l’imprécision entraîne quant à elle une variance dans les mesures répétées. Ces deux erreurs sont l’ennemi des données reproductibles.
Dans le passé, de nombreuses études d’analyse des images reposaient sur des mesures manuelles en vue d’une analyse quantitative. Au cours des vingt dernières années, nous avons assisté à une tendance vers l’analyse bio-informatique des images et à l’apparition d’outils logiciels, notamment des programmes d’intelligence artificielle capables d’automatiser les mesures et d’augmenter considérablement les cadences. Grâce à ces nouveaux outils, la quantité de données générées au cours des expériences de microscopie quantitatives a atteint de nouveaux sommets.
Comme les chercheurs produisent de plus en plus d’images par expérience, et que ces images alimentent des modèles complexes pour être analysées et pour en extraire des informations pertinentes, il est impératif de disposer dès le début d’un ensemble d’images le plus stable possible et de la plus haute qualité possible. Si la prise de vues se déroule sur plusieurs jours, un microscope ayant des performances instables pendant ce laps de temps va à coup sûr introduire de larges incohérences dans les données. Quelle que soit la puissance de votre logiciel d’analyse, c’est l’exactitude initiale de vos images qui aura le plus grand effet sur la cohérence et la fiabilité de vos données.
Ce ne sont pas seulement les cadences plus élevées et les logiciels d’analyse qui sont à l’origine des risques d’erreur. Les systèmes de microscopie actuels sont plus complexes que jamais et comportent une multitude de composants optiques, mécaniques et électriques. Le risque de mauvais alignement, de dysfonctionnement ou de défaillance de ces instruments augmente à mesure que le nombre de composants complexes augmente.
Alors, si la complexité des systèmes de microscopie ajoute un biais potentiel supplémentaire dans vos données, que pouvez-vous faire pour surveiller les performances de votre microscope et vous assurer de la cohérence de vos résultats ?
Outils et assistance pour vérifier les performances du microscope
Lorsque vous achetez un système de microscopie pour la première fois, les grands fabricants comme Evident vous fournissent un microscope bénéficiant de paramètres de performance stricts et très définis. Lors de l’installation, les installateurs suivent un protocole précis pour s’assurer que le microscope est conforme aux critères de performance d’usine.
Au fil du temps, certains indicateurs de performances peuvent faire des incursions en dehors de la plage acceptable, et c’est pourquoi une analyse des performances de votre microscope est si importante. Vous devez vous assurer que votre microscope fonctionne toujours avec le même niveau de performance, que cela fasse une journée, un mois ou une année que vous l’avez acheté.
Traditionnellement, l’obtention d’informations sur les performances du microscope était un processus laborieux, impliquant souvent l’élaboration d’une courbe d’étalonnage représentant l’intensité de sortie en fonction du pourcentage de transmittance au moyen d’outils d’étalonnage. La correction de problèmes affectant des paramètres spécifiques (la résolution ou l’homogénéité, par exemple) était également difficile par le passé, avec différents outils d’analyse nécessaires pour détecter des dysfonctionnements spécifiques.
Outils intégrés de surveillance des performances du microscope
Aujourd’hui, il existe des solutions plus simples et plus rapides qui rendent beaucoup plus aisée la surveillance des performances des microscopes. Prenons l’exemple suivant. Au cours d’une expérience de microscopie à intervalles longitudinale, certains systèmes de microscopie subissent des fluctuations de performance sur de longues périodes. Cela donne des images prises à intervalles de qualité variable.
Une solution contemporaine, le microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW™ FV3000, assure une puissance laser stable pour ces expériences. Un système de surveillance de l’intensité du laser optique et de rétrocontrôle dans l’unité de balayage assure une intensité d’excitation stable pendant les longues études d’imagerie à intervalles. Cette stabilité est bien visible dans les images prises à intervalles ci-dessous (figure 1).
Figure 1 – Images prises à intervalles avec un microscope confocal FV3000. Cellules NK de la lignée KHYG-1 (vert) changeant de forme pour attaquer et éliminer des cellules tumorales HT-29 marquées avec l’anticorps cétumixab (bleu). L’absorption d’iodure de propidium (IP) (rouge) indique la mort cellulaire.
Outils externes de surveillance des performances du microscope
Outre les solutions de microscopie intégrées pour assurer la surveillance des performances, il existe un certain nombre de solutions externes qui peuvent permettre aux utilisateurs de microscopes et aux fabricants de vérifier que l’équipement de microscopie fonctionne de manière optimale. Argolight est une entreprise spécialisée dans les solutions de contrôle de la qualité des microscopes. Cette entreprise a conçu une gamme de lames de contrôle de la qualité et un logiciel associé capables de détecter des fluctuations mineures de performances des microscopes.
Les solutions d’analyse des performances d’Argolight se présentent sous forme de lames ou de plaques à micropuits. Elles peuvent être utilisées pour contrôler la qualité dans une large gamme de systèmes de microscopes, notamment les microscopes à fluorescence. Ces solutions représentent un point de départ précieux pour les chercheurs qui ont des doutes sur les performances de leur microscope.
Figure 2 – Deux des 16 motifs fluorescents sont incorporés dans chaque lame Argolight HM.
Image de gauche : champ à motifs annulaires pour le contrôle de la planéité de l’image
Image de droite : motif de lignes verticales espacées de façon progressive pour vérifier la résolution
Mais comment fonctionnent-elles ?
En bref, les lames contiennent un dessin fluorescent géométrique de très haute définition avec une matrice de points focaux (exemples représentés ci-dessus à la figure 2). Des images de ces lames sont prises, puis les images sont analysées par le logiciel. Le logiciel peut notamment détecter tout biais dans les performances du microscope et détecter le degré de biais pour chaque paramètre. Si une valeur se situe en dehors de la plage acceptable déterminée par l’utilisateur, ces informations peuvent être renvoyées au fabricant ou service de microscopie sous la forme d’un rapport d’erreur concis.
Simplifiez la résolution des problèmes affectant votre microscope pour rester sur la bonne voie
Les solutions de contrôle rapide de la qualité des microscopes comme celles d’Argolight peuvent profiter à la fois à l’utilisateur et au fabricant. Par exemple, imaginons que vous ayez détecté un problème sur votre microscope. L’envoi d’un rapport d’erreur à notre équipe de techniciens de maintenance peut donner à ces derniers un point de départ pour résoudre votre problème. Grâce à ce rapport, ils peuvent rapidement identifier un composant spécifique susceptible de présenter un dysfonctionnement et vous poser des questions plus pertinentes et plus spécifiques pour résoudre le problème.
Le fait de disposer d’une vue d’ensemble des performances du microscope dans un même rapport, plutôt que de devoir recueillir des informations à partir de divers outils analytiques différents, peut faire gagner du temps et économiser de l’argent à l’utilisateur. Le technicien de maintenance peut déterminer rapidement le problème pour que les utilisateurs reprennent leur travail le plus tôt possible. En effet, une vue d’ensemble détaillée présentée dans un rapport succinct augmente la probabilité que nos techniciens puissent résoudre le problème à distance, ce qui permet aux utilisateurs de retourner à leurs recherches en n’ayant subi qu’une interruption minime de leur instrument.
Nous voyons déjà de nombreux clients profiter d’outils universels de résolution des problèmes qui garantissent une acquisition de données fiables, éliminent les biais introduits par le microscope, révèlent l’évolution des performances du système au fil du temps et leur permettent de tirer le meilleur parti de leurs expériences de microscopie quantitatives.
Vous avez besoin d’aide pour repérer des problèmes de performances de votre microscope pour l’analyse quantitative ? Contactez notre équipe de soutien à la clientèle dédiée ici.
Pour en savoir plus sur les solutions d’Argolight, vous pouvez les contacter à cette adresse.
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