L’imagerie de fluorescence nécessite un équilibrage délicat. D’un côté, vous devez acquérir un signal assez fort, que vous pouvez obtenir en utilisant un temps d’exposition plus long ou une lumière d’excitation plus intense. D’un autre côté, vous devez limiter la phototoxicité pour préserver les échantillons en réduisant le temps et l’intensité d’excitation.
Découvrez comment obtenir cet équilibre grâce à ces bonnes pratiques pour l’utilisation des caméras de microscope.
1. Utiliser un histogramme.
Un histogramme peut vous aider à déterminer la durée d’exposition idéale. Un histogramme est une représentation graphique de la distribution du niveau du signal. L’axe des abscisses de l’histogramme représente l’intensité du signal. Les données se répartissent du zéro au niveau de signal maximal de la caméra. La hauteur des barres de l’histogramme pour chaque valeur d’abscisse représente le nombre de pixels pour l’intensité du signal, comme illustré dans la figure 1 ci-dessous.
Figure 1 : histogramme d’une image. (a) Image originale, (b) intensité du signal pour chaque pixel de l’image originale, (c) histogramme créé à partir de l’image originale.
La forme et la distribution de l’histogramme nous indiquent si le temps d’exposition utilisé est approprié. Dans la majorité des cas d’imagerie de fluorescence, la plupart des pixels représentent le fond noir sans signal, ce qui se traduit par un pic autour du niveau de fond sur l’histogramme.
Si les barres de l’histogramme sont regroupées sur une plage de signaux de faible intensité, cela signifie que le temps d’exposition est trop court (figure 2, au centre). S’il y a une baisse abrupte après le maximum d’intensité du signal, cela signifie que la valeur de signal est saturée (figure 2, à droite). Dans ce cas, vous pouvez réduire l’intensité d’excitation ou raccourcir le temps d’exposition.
Figure 2 : histogramme avec une exposition normale (à gauche), en sous-exposition (au milieu) et en surexposition avec une saturation indiquée par la flèche jaune (à droite).
2. Alignement de l’étendue dynamique de l’affichage sur l’étendue dynamique des données.
Certains logiciels d’acquisition des images proposent une fonction d’ajustement automatisé de l’affichage qui procure une meilleure visualisation et un maintien des données de l’image originale, tout en définissant le lien entre l’intensité du signal et la luminosité affichée.
L’alignement de l’étendue dynamique de l’affichage avec l’étendue dynamique des données (la plage du niveau de fond au signal le plus intense) permet une meilleure visualisation tout en conservant les données de l’image originale (figure 3, à droite). Un histogramme permet de se représenter cet ajustement.
Figure 3 : Ajustement de l’affichage. (a) Réglage initial. L’intensité du signal affiché est beaucoup plus faible que l’étendue dynamique de l’affichage (255). (b) Affichage ajusté.
Maintenant que nous avons vu quelques conseils et outils utiles pour l’utilisation d’une caméra de microscope, mettons-les en pratique. Dans la prochaine section, je vais vous exposer les différentes étapes d’une procédure simple pour régler de façon optimale une caméra pour l’acquisition d’images de fluorescence.
Les six étapes à suivre pour régler les paramètres d’acquisition d’une caméra de microscope
Voici les six étapes à suivre pour régler correctement une caméra de microscope pour une expérience d’imagerie de fluorescence. Veuillez noter que la meilleure procédure dépend de votre application et de vos échantillons.
- Déterminez le grossissement à utiliser pour l’observation.
- Réglez la mise au point sur votre échantillon, et repérez la cible de votre observation. Le réglage automatique de l’affichage est recommandé. Fermez toujours l’obturateur de fluorescence lorsque vous n’observez pas le sujet ou lorsque vous ne prenez pas de photo.
- Faites les réglages de la caméra pour l’acquisition des images (c.-à-d. la résolution, la durée d’exposition).
- Essayez l’intensité de la lumière d’excitation la plus faible et allongez la durée d’exposition jusqu’à ce que vous obteniez un signal plus élevé que le bruit de fond.
- Si la durée d’exposition est vraiment trop longue, essayez d’augmenter légèrement l’intensité de la lumière d’excitation petit à petit.
- Vérifiez l’histogramme pour vous assurer qu’il n’y a pas de saturation.
Notez que ceci est une liste non exhaustive des bonnes pratiques. Pour plus d’instructions détaillées sur l’imagerie numérique, consultez notre article technique, Comprendre le lien entre les données d’images numériques et les échantillons biologiques.
Tenez toujours compte de votre échantillon et de votre application pour faire de l’imagerie de fluorescence
Le meilleur réglage pour l’acquisition des images dépend en définitive de votre échantillon et de votre application. Si votre échantillon est fragile, une excitation de faible intensité pourrait être préférable. D’un autre côté, une exposition plus courte avec une excitation relativement plus intense pourrait être mieux adaptée si vous devez prendre en photo un phénomène rapide. Dans tous les cas, l’histogramme et l’ajustement de l’affichage peuvent vous aider à déterminer les conditions d’acquisition optimales.
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