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Comment éliminer le flou des images des échantillons épais sans passer par l’approche confocale

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Image d’une lame entière d’une tranche de cervelet murin organotypique

Remyélinisation d’une tranche de cervelet murin organotypique 7 jours après la démyélinisation. Les axones sont visualisés par marquage de la chaîne lourde des neurofilaments NF-H en vert, la myéline est visualisée par marquage de la protéine basique de la myéline en rouge, et les corps cellulaires des oligodendrocytes sont marqués avec la GSTpi en bleu. Échantillon de Katherine Given, MS, université du Colorado à Denver. Image prise à un grossissement de 20x sur le scanner de lames pour la recherche SLIDEVIEW VS200 doté du module SILA.
 

Si les microscopes à fluorescence à grand champ permettent de prendre des images en haute résolution des échantillons minces, il n’en est pas de même pour les échantillons épais : leur capacité d’imagerie est limitée en raison de la fluorescence de fond qui rend l’image floue.

Alors, comment éliminer le flou des images des échantillons épais ? La réponse réside dans le sectionnement optique. Cette méthode permet de surmonter efficacement les limites de l’imagerie à grand champ, mais nécessite généralement un système confocal ou un logiciel de défloutage.

De nos jours, les scanners de lames pour la recherche sont dotés de la technologie de sectionnement optique. Cela signifie que les chercheurs peuvent bénéficier des capacités de la technologie confocale pour prendre des images des échantillons épais à une cadence considérablement améliorée. Nous explorons ici en détail les avantages de cette méthode de sectionnement optique tout en la comparant aux techniques traditionnelles.

Quelles sont les limites de l’imagerie à grand champ des échantillons épais ?

La microscopie à grand champ est une technique d’imagerie courante très efficace pour les échantillons minces (< 10 µm). En microscopie à grand champ large, la lumière provenant du plan focal et des plans au-dessus et en dessous du plan focal est captée par la caméra. Cela ne pose aucun problème pour les échantillons minces. Lors de l’imagerie d’échantillons épais, cette fluorescence de fond inévitable conduit à des images floues et faiblement contrastées, ce qui brouille les structures d’intérêt.

La microscopie confocale et d’autres méthodes d’éclairage par balayage permettent de surmonter ce problème. Elles fonctionnent en façonnant l’éclairage selon un motif fixe, ce qui permet d’obtenir une image optiquement sectionnée. Ces systèmes peuvent produire d’excellentes images dans des conditions favorables. Cependant, ils sont très coûteux. Ils dépendent également de l’éclairage de l’échantillon selon des motifs bien définis et contrôlés.

Présentation d’une approche d’éclairage différente pour l’imagerie des échantillons épais

Pour neutraliser les effets de la fluorescence de fond sur le contraste et la qualité de l’image, des motifs d’éclairage bien définis et contrôlés ne sont pas toujours nécessaires. Une technique connue sous le nom de microscopie HILO utilise des motifs aléatoires (éclairage granulaire / speckles) pour éclairer l’échantillon fluorescent. Ces motifs aléatoires présentent une intensité granulaire avec un contraste intrinsèquement élevé, ce qui donne un aspect granulaire aux images de fluorescence. Cette granularité produit du contraste et une indication directe du degré de netteté de l’échantillon.

Lors de l’imagerie HILO, deux images brutes sont prises et traitées. La première est une image ordinaire à grand champ avec un éclairage uniforme. Un filtre passe-haut est appliqué à cette image afin d’extraire les informations à haute fréquence, la partie « HI » (pour « high frequency ») de la microscopie HILO. Cette étape élimine les informations à basse fréquence, y compris les informations se trouvant dans le plan focal et en dehors du plan focal.

La seconde image est prise par éclairage par motifs aléatoires pour récupérer les informations à basse fréquence du plan focal. En d’autres termes, il s’agit de la partie « LO » (pour « low frequency ») de la microscopie HILO. Ces images sont traitées à l’aide d’un algorithme qui extrait les informations se trouvant dans le plan focal et élimine la fluorescence de fond. Les deux images sont ensuite fusionnées (figure 1) pour produire une image contenant des informations sur toute la plage de fréquences, la lumière en dehors du plan focal étant éliminée.

Le dispositif de sectionnement optique SILA est une solution d’imagerie à haute cadence pour nos scanners de lames pour la recherche SLIDEVIEW™ VS200 reposant sur la microscopie HILO. Il s’agit d’une technologie complémentaire destinée aux microscopes à grand champ qui élimine la lumière hors du plan focal. Elle permet notamment d’obtenir un sectionnement optique d’une netteté comparable à celle de la microscopie confocale. Le dispositif SILA peut facilement être ajouté à n’importe quel système VS200. Il présente des avantages pour un large éventail d’applications qui nécessitent une imagerie optique de haute qualité des échantillons épais.

Processus d’imagerie SILA d’une coupe de rein de souris

Figure 1 – Image d’une coupe de rein de souris prise à un grossissement de 20x. Le dispositif SILA du scanner VS200
associe une image prise avec un éclairage uniforme à une image prise avec un éclairage par
motifs aléatoires pour produire une image combinée d’une coupe optique parfaitement nette.

 

Un sectionnement optique ajustable à l’aide d’un paramètre

Étant donné que le dispositif SILA traite mathématiquement l’image à grand champ classique et l’image prise avec un éclairage par motifs aléatoires, il est possible d’ajuster le degré de sectionnement optique à l’aide d’un seul paramètre, à savoir l’épaisseur de sectionnement (ST). Lorsque l’épaisseur de sectionnement est réglée sur grande, les images comprennent des informations provenant d’une plus grande profondeur de champ. Cela donne l’apparence d’une image à grand champ.

La figure 2 représente une coupe de cerveau prise avec une épaisseur de sectionnement de 5. Avec cette grande épaisseur de sectionnement, de nombreux plans en dehors du plan focal subsistent. À mesure que l’on réduit l’épaisseur de sectionnement, les informations visibles sur l’image proviennent d’une profondeur de champ de plus en plus petite. Ainsi, lorsque l’on observe la coupe de cerveau prise avec une épaisseur de sectionnement de 2 et 1, les informations situées dans le plan focal subsistent, tandis que les éléments en dehors du plan focal ont disparu.

La possibilité d’optimiser le sectionnement optique de cette manière permet d’effectuer des observations à différentes profondeurs tout en éliminant la fluorescence de fond. Cet effet du dispositif SILA du scanner VS200 est comparable à celui obtenu avec les systèmes de microscopes confocaux en changeant la taille du sténopé.

Échantillon de cerveau de souris

Figure 2 – Image d’un échantillon de cerveau de souris marqué avec tdTomato acquise à un grossissement de 20x.
 

Élimination du flou dans les échantillons épais : comparaison de l’imagerie SILA aux autres techniques

Avant le développement du dispositif SILA, les scanners VS200 possédaient une autre solution pour éliminer la lumière hors plan focal des images à grand champ. Grâce au logiciel de déconvolution TruSight™, il est possible de déconvoluer des images à l’aide d’algorithmes itératifs contraints (IC) 2D. Cette approche logicielle permet d’éliminer une partie de la lumière hors plan focal. Cependant, elle ne permet pas d’optimiser le sectionnement optique ni d’éliminer autant de lumière hors plan focal que l’association du logiciel et du matériel utilisés dans le module SILA.

La déconvolution représente toutefois une option intermédiaire viable pour l’observation des échantillons minces lorsque le sectionnement optique SILA n’est pas disponible. La figure 3 illustre les différences de qualité entre une image classique à grand champ, une image déconvoluée par logiciel et une image SILA.

Image classique à grand champ, image déconvoluée par logiciel et image SILA d’une planaire d’eau douce

Figure 3 – Image de planaire d’eau douce Schmidtea mediterranea entière prise à un grossissement de 20X, avec mise en évidence des intestins. Bleu : DAPI. Vert : cellules internes de l’intestin. Rouge : cellules externes de l’intestin. Échantillons d’Amrutha Palavalli, Department for Tissue Dynamics and Regeneration, Max Planck Institute, Göttingen, Allemagne.
 

Applications d’imagerie SILA : des couches cellulaires épaisses aux échantillons de tissus

La technologie de sectionnement optique SILA peut apporter une valeur significative à de nombreuses applications de recherche, en particulier dans l’imagerie d’échantillons de couches cellulaires et de tissus épais fixés. Avec des fonctions d’optimisation du sectionnement et une élimination du flou et un contraste d’image comparables à ceux des microscopes confocaux, le système SILA produit une imagerie de haute qualité et une cadence considérablement améliorée.

La possibilité de réaliser des images d’échantillons épais est un avantage en neurosciences, domaine dans lequel les coupes tissulaires épaisses sont souvent nécessaires pour préserver la morphologie de l’échantillon. L’imagerie de coupes de cerveau est connue pour être difficile. Cela s’explique notamment par la propension des tissus cérébraux à produire un effet de diffusion de la lumière.

Habituellement, des systèmes de microscopie confocale ou à deux photons sont nécessaires pour prendre une image de haute qualité et fortement contrastée. Cependant, la réalisation d’une image d’une grande surface telle qu’une coupe de cerveau avec ces systèmes prend beaucoup de temps. La numérisation automatisée de lames assurée par le système VS200 doté du dispositif SILA accélère considérablement l’imagerie d’échantillons épais sur une grande surface. Il en résulte des images de haute qualité en un temps record (figure 4).

Image d’une lame entière de coupe de cerveau de souris

Figure 4 – Coupe de cerveau de souris de 200 μm. Vue d’ensemble acquise à un grossissement de 4x. Le gros plan est une image à profondeur de champ étendue (EFI) d’une série Z de 47 μm acquise à un grossissement de 20x. Bleu : DAPI. Vert : GFAP (glie). Jaune : MAP2 (neurones).
 

La recherche sur les organoïdes est un autre domaine qui bénéficie de l’imagerie SILA, car l’imagerie des organoïdes présente des défis semblables à ceux des neurosciences. L’imagerie des organoïdes est complexe en raison de l’épaisseur des échantillons, tandis que de grandes surfaces doivent être prises en image pour que la morphologie des organoïdes puisse être correctement étudiée.

En tant que scanner de lames entières, le système VS200 doté du module SILA peut assurer la couverture nécessaire à l’imagerie de ces grands échantillons. Par ailleurs, son traitement automatisé des images, sa fonction d’étalement du point (PSF) indépendante de l’échantillon et la simplicité de son utilisation permettent d’acquérir rapidement des images. Le dispositif SILA est également une solution d’un grand intérêt pour la recherche sur le cancer, la biologie spatiale, la botanique, à l’embryologie et de nombreuses autres applications qui nécessitent une imagerie de haute qualité des échantillons épais sur de grandes surfaces.

Principaux points à retenir sur l’imagerie SILA

L’imagerie SILA permet d’optimiser le sectionnement optique, de réduire le flou et d’améliorer le contraste de l’image de manière comparable aux microscopes confocaux à balayage laser sophistiqués. Avec une cadence nettement supérieure à celle des systèmes confocaux, le scanner de lames VS200 doté du dispositif SILA permet de réaliser rapidement des images de grands échantillons, habituellement difficiles à prendre en image, ce qui apporte des avantages considérables aux domaines des neurosciences, de la recherche sur les organoïdes et à bien d’autres domaines.

Envie d’en savoir plus sur le fonctionnement du dispositif SILA ? N’hésitez pas à nous contacter si vous avez des questions ou pour organiser une démonstration.

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Responsable de produit

Alec de Grand est responsable de produit pour la numérisation de lames et les microscopes droits pour les sciences de la vie chez Evident. Il travaille chez Evident depuis plus de 10 ans en tant que responsable des produits cliniques, des initiatives marketing, des formations en imagerie et des salons professionnels.

juin 25 2024
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