Méthodes de détection en microscopie confocale
La microscopie confocale est une technique classique d'examen de l'expression et des interactions des protéines dans des échantillons de tissus épais. Contrairement à la microscopie en épifluorescence à champ large, qui capte les photons émis dans l'ensemble du champ de vision (y compris les photons situés en dehors du plan focal), la microscopie confocale utilise un sténopé conjugué au plan focal pour rejeter la lumière hors foyer et créer une image optiquement coupée du seul plan du tissu concerné.
La méthode confocale est efficace pour obtenir des images nettes et haute résolution d'échantillons épais. Cependant, la perte de lumière due au sténopé complique la capture d'images avec un rapport signal sur bruit élevé. De ce fait, il convient de veiller à ce que le reste du train optique du microscope minimise efficacement l'exposition au laser nécessaire pour générer une image et détecter le plus grand nombre possible de photons émis.
Différences entre les techniques de détection de lumière par filtre et spectrale
Dans le cadre de la détection par filtre, vous placez un filtre passe-bande devant votre tube photomultiplicateur (PMT) pour sélectionner les longueurs d'onde de lumière envoyées vers votre détecteur. Dans le cadre de la détection spectrale, un réseau ou un prisme est utilisé pour créer un spectre de la lumière émise, vous permettant de régler avec précision la ou les bandes du spectre d'émission que vous souhaitez détecter.
La détection spectrale vous permet également d'effectuer des « balayages lambda » : le spectre entier de la lumière émise peut être analysé selon des largeurs de bande et des tailles de pas spécifiques.
Si les méthodes de détection spectrale permettent de réaliser des expériences plus flexibles, leur point faible reste la sensibilité. La détection spectrale offre une plus grande flexibilité, tandis que la détection par filtre est généralement plus efficace.
Origines de la spectroscopie en microscopie
Pour créer un spectre, la technologie de détection spectrale repose sur deux méthodes : des réseaux de diffraction par réflexion et des systèmes à prisme. La technologie de réflexion a été introduite dans le premier microscope confocal commercialisé à la fin des années 1990 (figure 1). Le système confocal à prisme a fait son apparition peu de temps après.
Comme indiqué ci-dessus, les méthodes de détection spectrale sont généralement moins efficaces que les méthodes basées sur des filtres. Trois facteurs contribuent à cette différence en termes d'efficacité :
- Pertes de diffraction d'ordre supérieur : lorsque la lumière est réfléchie sur un réseau de diffraction, plusieurs ordres de diffraction sont créés. Seul le premier ordre de diffraction suit le chemin de détection, entraînant la perte des ordres de diffraction supérieurs.
- Perte liée à la polarisation : la réflexion de la lumière diffère selon l'état de polarisation, l'efficacité de diffraction de la lumière polarisée P étant inférieure à celle de la lumière polarisée S dans le cadre de réseaux de réflexion.
- Efficacité des réseaux de réflexion liée aux longueurs d'onde : l'efficacité de la diffraction atteint son niveau maximum à une certaine longueur d'onde. Elle sera ainsi réduite à des longueurs d'onde supérieures ou inférieures.
Les réseaux de diffraction par réflexion sont affectés par ces trois facteurs et constituent la méthode de détection spectrale la moins efficace. Si les méthodes de détection par prisme résolvent le problème de perte de lumière de diffraction d'ordre supérieur, la résolution spectrale en pâtit à des longueurs d'onde supérieures. En raison de ces inconvénients, aucune de ces technologies n'a su se substituer entièrement aux systèmes de détection par filtre.
Figure 1 : Chronologie de la microscopie confocale et des technologies de détection spectrale
Unité holographique en phase volumique : une autre approche des réseaux
Pendant près de 20 ans, la majorité des applications de spectroscopie des microscopes confocaux de tous les fabricants ont reposé sur les réseaux de diffraction par réflexion et les technologies à prisme. Cependant, à l'instar du domaine de la microscopie, l'astronomie utilise également la spectroscopie pour produire des images. Par rapport à la microscopie, la spectroscopie est utilisée de manière similaire en astronomie : les objets d'intérêt astronomique (tels que les galaxies et autres corps célestes) émettent également de la lumière allant de l'ultraviolet à l'infrarouge, et les astronomes doivent être capables de différencier ces composantes de la lumière afin d'en produire des images précises (figure 2).
Figure 2 : Application de la spectroscopie en astronomie pour produire l'image d'une galaxie.
Crédits : NASA, ESA, Dan Maoz (Université de Tel-Aviv, Israël, et Université Colombia, États-Unis)
L'une des principales technologies utilisées par les astronomes à cette fin est l'unité holographique en phase volumique (VPH). Au lieu de réfléchir la lumière sur un réseau à relief de surface pour produire un spectre de lumière, les réseaux VPH utilisent une approche transmissive, faisant passer la lumière à travers un réseau pour diffracter la lumière incidente en plusieurs composantes spectrales (figure 3). Les premières expériences d'astronomie utilisant des réseaux VPH ont été publiées vers l'année 2000, et la technologie a été rapidement adoptée. Depuis lors, des réseaux VPH à très grande échelle ont été mis en œuvre avec succès à des fins de spectroscopie dans certains des plus grands laboratoires du monde.
Figure 3 : Schémas de coupe transversale des mécanismes de diffraction par réseaux à relief de surface et réseaux holographiques en phase volumique. Les réseaux à relief de surface (à gauche) réfléchissent la lumière à la surface du réseau, tandis que les réseaux VPH (à droite) transmettent la lumière à travers le réseau.
La technologie VPH a été mise en œuvre dans un microscope commercial pour la première fois en 2016, avec le lancement du microscope confocal FLUOVIEW™ FV3000 doté de la technologie de détection TruSpectral™, qui utilise un système VPH pour permettre la diffraction de la lumière par transmission. L'utilisation de réseaux VPH comporte de nombreux avantages, parmi lesquels :
- Faible sensibilité à la polarisation
- Faible dispersion (haute efficacité)
- Transmission élevée sur l'ensemble du spectre (notamment en lumière rouge par rapport aux réseaux de diffraction par réflexion)
- Meilleure flexibilité que les filtres
La technologie TruSpectral utilise un réseau de diffraction par transmission, lui permettant ainsi de relever nombre des défis généralement associés aux méthodes de détection spectrale classiques. Par exemple, elle garantit des pertes liées à la polarisation minimes par rapport aux pertes importantes qui se produisent généralement avec les réseaux de diffraction par réflexion. De plus, le système VPH élimine la dépendance de l'efficacité de la diffraction aux longueurs d'onde. Les réseaux par réflexion présentent un angle fixe et ne peuvent être optimisés que pour une seule longueur d'onde, alors que l'angle du réseau VPH peut être contrôlé afin d'optimiser l'efficacité quelle que soit la longueur d'onde de détection. Cette caractéristique permet d'optimiser l'efficacité de la transmission sur l'ensemble du spectre, notamment à de grandes longueurs d'onde.
Fonctionnement des réseaux VPH dans le microscope FV3000
Notre application du système VPH à notre technologie de détection TruSpectral dans notre microscope confocal FV3000 repose sur trois fonctionnalités clés (figure 4) :
- Un ajustement motorisé de l'angle du réseau VPH permettant d'optimiser automatiquement son angle en fonction des longueurs d'onde de la lumière détectée
- Un miroir lambda motorisé réglable, qui est utilisé pour diriger des portions spécifiques du spectre produit par le réseau VPH vers le tube photomultiplicateur
- Une fente motorisée réglable juste devant le tube photomultiplicateur, qui peut être ajustée librement de 1 nm à 100 nm selon des pas de 1 nm
Ces fonctionnalités réunies permettent une détection spectrale linéaire haute résolution de 400 nm à 800 nm.
Figure 4 : Schéma du système de détection basé sur un réseau VPH dans le microscope confocal FV3000
Avantages de la détection TruSpectral aux fins de l'imagerie par fluorescence à l'aide de fluorophores rouges
Le réseau VPH offre une meilleure flexibilité ainsi qu'une amélioration significative de l'efficacité de transmission du système de détection, notamment dans la fenêtre rouge à rouge lointain (figure 5).
Les fluorophores rouges sont de plus en plus utilisés dans les applications d'imagerie, car la lumière déplacée vers le rouge est moins phototoxique, permet une meilleure pénétration en profondeur dans les tissus et étend les capacités de multiplexage. Cependant, il est souvent difficile d'obtenir des images de fluorophores rouges à l'aide des technologies d'imagerie spectrale traditionnelles en raison de la faible efficacité de transmission et de la mauvaise résolution spectrale des réseaux et prismes de diffraction par réflexion. La détection spectrale par réseaux VPH assure une meilleure transmission de la lumière rouge et préserve la précision et la résolution du spectre obtenu, permettant une résolution spectrale précise de 1 nm jusqu'à 800 nm.
Figure 5 : Comparaison de l'efficacité de transmission de la technologie de détection TruSpectral par réseau VPH dans le microscope confocal FV3000 par rapport aux réseaux de diffraction par réflexion utilisés dans le microscope FV1200. L'utilisation de réseaux VPH permet d'obtenir une transmission jusqu'à trois fois supérieure à celle des méthodes traditionnelles de détection spectrale.
Les améliorations apportées par le réseau VPH nous ont permis de concevoir et de créer le microscope FV3000 comme un système à visée entièrement spectroscopique. Ainsi, chaque détecteur utilise la technologie de détection TruSpectral par réseaux VPH, comme le montre la figure 4. Grâce à un système entièrement spectral doté de canaux indépendants, vous pouvez démêler plusieurs signaux d'intensité variable afin de détecter simultanément les fluorescences brillantes et pâles (figure 6).
Figure 6 : Le « balayage lambda » spectral de cellules COS-7 permet de séparer clairement les signaux qui se chevauchent
De l'astronomie à la microscopie, les réseaux VPH constituent un puissant outil dans le cadre de la réalisation d'expériences de spectroscopie. Suivez-nous pour connaître la prochaine étape de ce voyage.
Figure 7 : Comparaison d'applications de la spectroscopie en astronomie et en microscopie. En haut : séparation spectrale de la lumière émise par différents corps célestes au sein d'une galaxie. En bas : séparation spectrale de quatre structures différentes au sein d'une cellule. Crédits des images du haut : NASA, ESA, Dan Maoz (Université de Tel-Aviv, Israël, et Université Colombia, États-Unis)
